摘要：针对目前饲用复合酶制剂活力检测方法问题，本实验选择了还原糖法，并根据动物肠道内环境等实际情况，选择了测定温度40℃、PH4.6,反应时间为30分钟,其中酸性蛋白酶的测定选择PH3.0的条件.
关键词:饲用复合酶制剂 酶活力 反应条件 测定方法
饲用复合酶制剂大多为多菌混合固体发酵制得，其功能因子为水解酶，包括纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶、β——葡聚糖酶、甘露聚糖酶等多种酶。
目前，国内外文献及各酶制剂公司提供的用于测定酶活力的方法很多，如还原糖法、粘度法、色原底物法和放射琼脂扩散法等。还原糖法是测量一种酶在其特定基质上“切断”的数目，该方法已被证明比较准确并且可再复制，是常被使用的一种方法；粘度法的原理在本质上是相同的，但偏向那些可切断基质中间位置的酶，该方法非常费时而且比较复杂；其它方法重复性差，费时，操作复杂，反应颜色不稳定，而且单位难以换算成酶活力单位。
本方法在大量试验的基础上，选择了反应颜色稳定性好，操作简单的还原糖法。其中，酸性蛋白酶的测定采用通用方法——分光光度法。
酶活力的试验方法涉及到酶活力的定义、底物、测定温度、PH值、反应时间、测定方法等多种因素。为使试验结果能相互比较，本方法对酶活力的定义、底物等各种因素分别进行了规定。在对饲用复合酶制剂的研究中，根据各种酶的特性，结合实际情况，确定了酶活力试验的最适反应温度、PH值、反应时间。
1.技术要求
1.1 外观：本品为黄褐色粉状物、无结块、无潮解现象。
1.2 气味；发酵香味、无异味。
2.试验方法
2.1 外观与气味：取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测判定及辨味。
2.2 纤维素酶活力测定。
2.2.1 定义：在40℃、PH4.6条件下，1分钟分解羧甲基纤维素钠产生相当于1ug同葡萄糖的还原糖量所需的酶量，规定为一个酶活力单位，以u/g表示。
2.2.2 原理：纤维素酶从羧甲基纤维素钠中分解出还原糖，还原糖又同3.5—二硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，可用分光光度计测定其色度，计算酶活力。
2.2.3 试剂和溶液
2.2.3.1 0.1mol/1醋酸——醋酸钠缓冲液（PH4.6）；
称取结晶醋酸钠（CH3COONa）13.61g,醋酸（CH3COOH）（浓度99.5%以上）6.00g.用蒸馏水溶解，并定容至1000ml.
2.2.3.2 3,5—二硝基水杨酸试剂（又称DNS试剂）：
称取酒石酸钾钠182.0g，溶解于500ml蒸馏水中，加热（不超过50℃） ，于热溶液中依次加入3,5二硝基水杨酸6.3g,氢氧化钠21.0g,苯酚5.0g,无水硫酸钠5.0g,搅拌均匀至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10天后使用。
2.2.3.3 20.00mg/ml羧甲基纤维素钠溶液
称取2.000g羧甲基纤维素钠，(sigma公司生产）准确至0.001g,用缓冲液（4.2.3.1）溶解，并定容到100ml.
2.2.3.4 1mg/ml 葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70℃、600mm汞柱下干燥5小时至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml冰箱保存备用。
2.2.4 仪器、设备
分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。
2.2.5试验步骤
2.2.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制:分别取1mg/ml 葡萄糖标准液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml依次加入7支25ml的比色试管中，以蒸馏水补加到2.0ml,再加入DNS试剂1.5ml,在沸水中煮沸5min,流水冷却,加蒸馏水21.5ml摇匀,在540nm处进行比色测定,用空白管溶液调零点,记录吸光度值,以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线.
2.2.5.2 待测酶液的制备:
称取酶粉1.0g,先用少量的0.1mol/L,PH4.6的醋酸—醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣碎,将上层清液倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再用少量上述缓冲液溶解，如此反复捣研3—4次，最后全部移入溶量瓶中，用缓冲溶液定溶至刻度,用脱脂棉过滤,滤液供测定用.
2.2.5.3 测定
于25ml比色管中加入1ml适当稀释的酶液,在40℃水浴锅中预热5min后加1.00ml羧甲基纤维素钠溶液(2.2.3.3),计时,置40℃水浴保温30min后立即加入1.5mlDNS试剂终止反应,再置沸水中煮沸5min,流水冷却,加蒸馏水至25ml摇匀,以煮沸5min灭火酶液加1.00ml底物溶液(2.2.3.3)同上操作为空白.按照做标准曲线时同样的操作测定光密度值(0.D.),用回归方程计算出相应的葡萄糖含量.
2.2.6 计算
W× n× 1000
X=-------------
T × M
式中 X-----酶活力单位,u/g.
W——用回归方程计算出的相当的葡萄糖mg数；
n——酶液稀释总倍数；
T——反应时间（30min)；
M——样品重量，g.
1000——将毫克换算成微克的换算系数。
2.2.7结果的允许偏差
平行试验相对 偏差不得超过3%，否则重新测定。
2.3半纤维素酶活力测定
2.3.1定义：在40℃、PH4.6条件下,1h分解木聚糖生成1mg木糖所需的酶量,规定为1个酶活力单位以u/g表示.。
2.3.3试剂和溶液。
2.3.3.1 0.1ml/L醋酸—醋酸钠缓冲液（PH4.6）配制方法同2.2.3.1。
2.3.3.2 DNS试剂，配制方法同2.2.3.2
2.3.3.3 20.00mg/ml木聚糖溶液:
准确称取2.000g 木聚糖(sigma公司生产） ,先用适量的缓冲液(2.3.3.1)溶解,在沸水浴中加热,使其完全溶解,冷却后移入100ml容量瓶,用上述缓冲液定容至100ml。
2.3.3.4 1mg/ml木糖标准液:
准确称取100mg分析纯木糖(预先在70℃、600mm汞柱下干燥5小时至恒重)，用少时蒸馏水溶解，定溶至100ml，冰箱保存。
2.3.4仪器、设备同2.2.4。
2.3.5试验步聚。
2.3.5.1木糖标准曲线的绘制.
以木糖代替葡萄糖,其余操作同2.2.5.1葡萄糖标准曲线的绘制步骤。
2.3.5.2待测酶液制备同2.2.5.2
2.3.5.3测定
以木聚糖溶液(2.3.3.3)代替羧甲基纤维素钠于比色管中,40℃保温,30min，DNS试剂终止反应，以灭活酶液加1ml底物溶液（2.3.3.3）反应30min作对照,按标准曲线的操作测定分光光度值,用回归方程计算出相应的木糖含量.
2.3.6计算
W×n
X=----------
T×M
式中 X—酶活力单位，u/g;
W—用回归方程计算出的相当的木糖mg数；
n—酶液稀释总倍数；
T—反应时间（0.5h)
M—样品的重量，g.
2.3.7结果的允许偏差
平等试验相对偏差不得超过3%,否则重新进行测定.
2.4果胶酶活力测定
2.4.1定义:在40℃条件下,1h分解果胶生成1mg半乳糖醛酸所需的酶时规定为1个酶活力单位,以u/g表示.
2.4.2原理:果胶酶在一定的条件下水解果胶,生成半乳糖醛酸,此产物具有还原性醛基可与DNS发生成色反应,可用分光光度计测定其色度,计算酶活力.
2.4.3 试剂和溶液
2.4.3.1 0.1mol/L醋酸—醋数钠缓冲液（PH4.6）:
配制方法同2.2.3.1。
2.4.3.2 DNS试剂：配制方法同2.2.3.2。
2.4.3.3 20mg/ml果胶溶液:称取2.000g果胶(sigma公司生产）,先用适量温热的缓冲液(2.4.3.1)浸泡,然后在沸水浴中加热完全溶解,冷却后用上述缓冲液定溶至100ml。
2.4.3.4 1mg/ml半乳糖醛酸标准液:称取100mg分析纯半乳糖醛酸(预先在70℃、600mm汞柱下干燥5小时至恒重)，用少量蒸馏水溶解，定溶至100ml，冰箱保存备用。
2.4.4 仪器、设备，同2.2.4。
2.4.5试验步骤;
2.4.5.1半乳糖醛酸标准曲线的绘制
以半乳糖醛酸标准液代葡萄标准液,其余操作同2.4.5.1。
2.4.5.2待测酶液的制备:同2.2.5.1。
2.4.5.3测定
1ml适当稀释酶液加 1ml 20mg/ml果胶溶液,40℃水浴保温30min,加DNS试剂终止反应;以灭活酶液加1 ml底物溶液(2.4.3.3)反应30min作对照,按制作标准曲线时同样的操作测定吸光光度值,用回归方程计算出相应的半乳糖醛酸含量。
2.4.6计算
W×n
X=-----------
T×M
式中X—酶活力单位。U/g；
W—回归方程计算出的相当的半乳糖醛酸mg数；
n—酶液稀释总倍
T—反应时间（0.5h）
M—样品的重量，g
2.4.7结果的允许偏差
平行试验相对偏差不得超过3%,否则重新进行测定。
2.5淀粉酶活力测定
2.5.1定义:在于40℃的条件下,1h水解淀粉生成1mg葡萄糖所需的酶量,规定为1个酶活力单位,以u/g表示.
2.5.2原理:淀粉酶具有催化淀粉水解的能力,从淀粉链的非还原性末端开始,分解α—1,4糖苷键,生成葡萄糖,产物与DNS试剂 发生反应,产生一种黄橙混合色,可用分光光度计测定其色度,计算其酶活力.
2.5.3试剂和溶液
2.5.3.1 0.1mol/L醋酸—醋酸钠缓冲液:配制方法同2.2.3.1。
2.5.3.2 DNS试剂:配制方法同2.2.3.2.
2.5.3.3 20mg/ml可溶性淀粉液:称取2.0000g可溶性淀粉,先用少量缓冲溶解后,徐徐倾入已煮沸的缓冲液中,继续煮沸至透明,冷却后用缓冲溶液定溶至100ml。
2.5.3.4 1mg/ml葡萄糖标准液:配制方法同2.2.3.4。
2.5.4 仪器、设备，同2.2.4。
2.5.5 试验步聚
2.5.5.1葡萄糖标准曲线的绘制:绘制方法同2.2.5.1。
2.5.5.2待测酶液的制备:同2.2.5.2。
2.5.5.3测定
1ml适当稀释的酶液加1ml 20mg/ml的可溶性淀粉液,40℃水浴保温30min加DNS终止反应;
以灭活酶液加1ml底物溶液(2.5.3.3)保温30min作对照,按制作标准曲线同样的操作测定吸光光度值,用回归方程计算出相应的葡萄糖含量.
2.5.6计算
W×n
X=-----------
T×M
式中： X—酶活力单位，u/g;
W—用回归方程计算出的相当的葡萄糖mg数；
n—酶液稀释总倍数；
T—反应时间(0.5h) M—样品的重量，g.
2.5.7 结果的允许偏差 平行试验相对偏差不得超过3%,否则重新进
2.6 β—葡聚糖酶活力的测定
2.6.1 定义:在40℃—PH4.6的条件下,1min水解β—葡聚糖生成1ug葡萄糖的还原糖所需的酶量，规定为一个酶活力单位，以u/g表示
2.6.2 原理
β—葡聚糖酶以β—葡聚糖为底物发生水解反应，从中分解出还原糖,还原糖又同3,5—二硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，可用分光光度计测定其吸光光度值，计算其酶活力。
2.6.3 试剂和溶液
2.6.3.1 0.1mol/mL醋酸—醋酸钠缓冲液（PH4.6）配制方法同2.2.3.1
2.6.3.2 DNS试剂 配制方法同2.2.3.2
2.6.3.3 20.00mg/mlβ——葡聚糖溶液
准确称取2.000g β——葡聚糖，用缓冲液（2.2.3.1）溶解，并定容到100ml.
2.6.4 仪器与设备 同2.2.4
2.6.5 试验步骤
2.6.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制 同2.3.5.1
2.6.5.2 待测酶液的制备 同2.2.5.2
2.6.5.3 测定
以β——葡聚糖代替羧甲基纤维素钠2.2.3.3，其余操作同2.2.5.3。
2.6.6 计算公式：
W×n×1000
X= ---------
T×M
式中 X-----酶活力单位,u/g.
W--作回归方程中计算出的相当的葡萄糖的质量，mg；
n--酶液稀释总倍数；
1000--将mg换算为ug数
T——反应时间（30min） M—样品的重量，g.
2.6.7 结果的允许偏差
平行试验相对偏差不得超过3%，否则重新测定。
2.7 酸性蛋白酶活力测定
2.7.1 定义：在40℃、PH3.0条件下,每分钟水解酪产生相当于1ug酪氨酸所需的酶量,规定为一个酶活力单位以u/g表示.
2.7.2 原理：磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林——酚试剂，减性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈兰色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，测定蛋白酶的活力。
2.7.3 试剂和溶液
2.7.3.1 乳酸缓冲液（PH3.0）
甲液：称取乳酸（80%—90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液： 称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.
使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
2.7.3.2 福林试剂：于200ml烧瓶回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g，钼酸钠（Na2MO4·2H2）25g蒸馏水700ml,85%磷酸50ml,浓盐酸100ml,小火回流10小时，去除冷凝器后加入硫酸锂（Li2SO4）50g,蒸馏水50ml和数滴浓溴水摇匀，在通风橱内再进行煮沸15分钟，以去除多余的溴（冷后若仍有绿色需再加溴水，再煮沸去过量的溴）。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，混合均匀过滤。试剂呈金黄色贮于棕色试剂瓶内。使用时以1份原福林溶液与2份蒸馏水混匀（即为福林工作液）。
2.7.3.3 0.4mol/L碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.
2.7.3.4 0.4mol/L的三氯醋酸液:称65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml
2.7.3.5 20.00mg/mL酪素溶液
称取酪素2.000g,准确至0.001g,用2-3滴浓乳酸湿润后,加入PH3.0的乳酸缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用缓冲液(4.7.3.1)稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.
2.7.3.6 10.00mg/mL酪氨酸标准溶液
a.准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/mL的酪氨酸溶液.
b.吸取1.00mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0ug/mL L-酪氨酸标准溶液.
2.7.4 仪器、设备、同4.2.4。
2.7.5 试验步骤
2.7.5.1 标准曲线的绘制
a. L-酪氨酸标准溶液按表3配制。
b. 分别取上述溶液各1.00ml(须做平等试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml.福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,10min比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
表3. 酪氨酸标准溶液的配制
管号
酪氨酸标准溶液的浓度（ug/mL）
取100.0ug/mL酪氨溶液的体积（Ml）
加水体积（mL）
0
0
0
10.00
1
10.00
1.0
9.00
2
20.00
2.0
8.00
3
30.00
3.0
7.00
4
40.00
4.0
6.00
5
50.00
5.00
5.00
2.7.5.2 待测酶液的制备
称取1.0g 酶粉，准确至0.001g,用少量乳缓冲液（4.7.3.1）浸润，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲液如此溶解、捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，用滤纸过滤，过滤根据酶活力大小再一次用缓冲液（4.7.3.1）稀释至适当浓度，使被测试液吸光度值在0.25-0.40范围内。
2.7.5.3 测定： a.先将酪素溶液放入40+0.2℃恒温水裕中，预热5min
b.按下列程序操作：
试管A（空白）
↓
加酶液1.00ml
40+0.2℃, 预热2min
↓
加三氯乙酸2.00ml摇匀
40+0.2℃, 保温10min
↓
加酪素1.00ml,摇匀
↓
取出静置10min,过滤
↓
取1.00ml滤液
↓
加碳酸钠溶液5.00ml
↓
加福林试剂使用液1.00 ml
40+0.2℃,显色20min
试管B（酶试样，需作三个平行）
↓
加酶液1.00ml
40+0.2℃, 预热2min
↓
加酪素1.00ml,摇匀
40+0.2℃, 保温10min
↓
加三氯乙酸2.00ml摇匀
↓
取出静置10min,过滤
↓
取1.00ml滤液
↓
加碳酸钠溶液5.00ml
↓
加福林试剂使用液1.00 ml
40+0.2℃,显色20min
于680nm波长处用10mm比色皿以试管A为空白，测定吸光度值。
2.7.6 计算公式
W×n×4
X=──────
10×M
式中X——酶活力单位，u/g;
W——作回归方程中计算出的相当的酪氨酸的质量，ug;
4——反应试剂的总体积，ml;
n——酶液稀释总倍数；
10——酶解反应时间，min；
M——样品质量，g.
2.7.7 结果的允许偏差
平行试验相对偏误差不得超过3%，否则重新进行测定。
2.8 水分：按GB6435-86饲料水分测定法执行。
2.9 粒度：按GB5917-86配合饲料粉碎粒度测定法执行。
2.10 酶活力保存率：计算方法如下：
E1
X=-------×100
E
式中X--酶活力保存率，%；
E1--测定酶活力，u/g；
E--样品的标准酶活力，u/g；
2.11砷（以as计）：按GB13079--91饲料中总砷的测定方执行。
2.12铅（以pb计）：按GB13080--91饲料中铅的测定方法执行。
2.13黄曲霉毒素B：按GB8381--87饲料中黄曲霉毒素B测定方法执行。
2.14沙门氏菌：按GB13091--91`饲料中沙门氏菌的检验方法执行。
3.本产品在运输及贮存过程中，应防雨、防尘、防日光曝晒；装卸时应轻拿轻放，码放整齐，防止倾压；在运输过程中，严禁与有毒有害、有腐蚀物质及其他污染物混装、混贮、混运，并贮存于清洁、阴凉、干燥、通风的库房中。在上述条件下，保质期一年。
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