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刘 杰 徐 林 吴根福
摘 要 硒是一种动物必需的微量元素，在过氧化物的分解和自由基的清除、机体免疫力的调节、有毒元素的拮抗等方面发挥着重要作用。富硒酵母由于食用安全性强、生物利用率高等优点而成为首选的补硒添加剂。富硒酵母生产时应注意将培养基的糖度控制在4%左右，培养基中硫含量尽可能少，通气要充分，无机硒的添加应采用分批添加或流加的方式。利用分光光度法、荧光法或氢化物原子荧光光谱法可以测出富硒酵母中的有机硒含量。
关键词 硒酵母；生理作用；生产；测定
中图分类号 S816.7
硒（Selenium，Se）是一种氧族元素，长期以来一直被认为是有毒物质，因为过量食用富硒谷物不但会引发癌症，严重时还可导致死亡，但缺硒同样会引起许多疾病，如引起猪的肝坏死和心肌、骨骼肌病变[1]，而且硒还是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的组分，对维持该酶的抗氧化活性起着不可替代的作用[2]。因此，世界卫生组织于1973年将硒定为人和动物必需的微量元素，同年，美国FDA也批准亚硒酸钠和硒酸钠可作为饲料添加剂应用于动物养殖业。
虽然无机硒也能参与肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶的合成，对缺硒引起的疾病起预防和治疗作用，但富硒酵母因具有硒利用率高、毒性低、对环境污染小等优点，更适宜作为补硒添加剂。
1 硒的生理作用
硒是一种重要的微量元素，经胃肠道吸收后，通过血液运输至各组织，主要分布于肾、肝、胰、垂体及毛发等部位，而在肌肉、骨骼中相对较少。硒主要以硒代半胱氨酸（selenocysteine）的形式由密码子UGA介导插入到蛋白质中，构成酶的活性中心组分[3]。人类基因组序列的分析和相关试验证明，哺乳动物中至少存在25种硒蛋白，大多数是重要的功能酶，如谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶、碘化甲腺氨酸脱碘酶、硒磷酯合成酶和硒蛋白P等[4]。硒缺乏不仅会引起克山病和大骨节病，还可导致白内障、肝坏死、胰腺纤维化等疾病。
1.1 参与过氧化物的分解和自由基的清除
硒是谷胱甘肽过氧化物酶的组分,参与过氧化物的分解、自由基的清除和膜磷脂氢过氧化物的还原等反应,具有保护细胞膜,特别是动脉血管壁上皮细胞细胞膜的功能,在防止动脉粥样硬化、减少血栓和心肌梗死发生等过程中发挥着重要的作用。牛的谷胱甘肽过氧化物酶是一种四聚体水溶性蛋白,每一亚基有178个氨基酸,其中第35位的硒代半胱氨酸位于活性中心内。催化过程中,过氧化物(ROOH)在将硒醇(-SeH)氧化成硒次磺酸衍生物(-SeOH)的同时，被还原成无毒的羟基化合物(ROH)，而被氧化的酶活性中心可由谷胱甘肽来还原[5]。用奶牛、蛋鸡、仔猪、小鼠等进行的试验都证明补硒后血液中的谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力显著增加,血液的总抗氧化能力、谷胱甘肽含量上升,而丙二醛含量显著下降,说明补硒能显著提高动物的氧化应激水平[4，6]。
1.2 增强机体免疫力
硒在抗传染免疫方面发挥着重要作用，可刺激细胞因子受体的表达和淋巴细胞的增殖，促进抗体产生，增强吞噬细胞的吞噬能力，从而有效地抵御各类病原微生物的侵袭[7]。如富硒酵母能诱导人体产生较强的抗结核细胞免疫应答反应，提高淋巴细胞增殖指数和细胞毒T淋巴细胞的杀伤活力，增加血液中白细胞介素-2和γ-干扰素的含量，提高淋巴细胞颗粒酶B及穿孔素的表达量[8]；富硒酵母还能升高猪血清中球蛋白与白蛋白的比值，增加中华鳖的红细胞数量、提高红细胞C3b受体花环率和红细胞天然免疫黏附肿瘤细胞花环率[9]。
硒在癌症免疫方面也发挥着重要作用，可抑制癌细胞DNA复制、RNA转录和蛋白质合成，干扰致癌物质的代谢。流行病学的研究表明，胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、皮肤癌、白血病和结肠直肠癌的发病率和死亡率与硒的摄入量、血清中的硒含量呈负相关[10-12]。补硒双盲试验的结果表明，服硒组的总癌发生率和死亡率分别比对照组降低37%和50%，肺癌、前列腺癌、结直肠癌的发生率分别降低46%、63%和58%[13]；江苏省启东市对肝癌的干预研究、河南省林县对食管癌的干预研究、印度对口腔癌的干预研究都证明补硒可降低癌症的发病率[8，14]。至于硒的抗癌机理目前还不是很清楚，很可能与癌血管形成的抑制和癌细胞凋亡的诱导有关。硒可使乳腺癌小鼠的癌微血管密度大大降低，可抑制人类乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-468血管内皮生长因子的表达[15]。硒酸盐、硒谷胱甘肽能诱导早幼粒细胞白血病IL-60细胞系的凋亡，甲基硒氰酸盐和甲基硒半胱氨酸能诱导乳腺瘤内皮细胞的凋亡。硒诱导的细胞凋亡既不会引起DNA损伤，也不需要抑癌基因p53参与，其可能机制是降低细胞循环蛋白激酶CDK2的活性，从而阻止细胞从G1/S期继续分裂[16]。
1.3 拮抗有毒物质
硒能保护人和动物的组织细胞免于有毒物质的侵害，对有害金属元素起拮抗作用[17]。如可减少镉的吸收，降低镉在体内的蓄积，缓解由镉诱导的肾毒性，抑制镍的致癌作用和砷的致畸作用，预防甲基汞中毒，还可降低铅、氟、银等的毒性。
硒能拮抗铅所致的神经系统损害。大鼠经口染铅（20 mg/kg体重）后，大脑和小脑中己糖激酶、ATP酶、乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶活性下降，从而影响胆碱能和肾上腺素能神经递质的释放。若同时给予硒，可使这四种酶的活性接近或达到正常水平；染铅8周后，可观察到大鼠大脑皮质明显的退行性变化，DNA、RNA和蛋白质含量明显降低，而给硒的对照组大鼠的大脑皮质横断面只有缘性改变，DNA、RNA和蛋白质含量下降不多[18]。
硒与金属有很强的亲和力，在体内可结合成金属硒蛋白。雄性大鼠预先注射硒酸钠（10 μmol/kg体重）可预防因肌注醋酸铅（100 μmol/kg体重）而导致的肝脏和肾脏脂质过氧化，并提高这些部位的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽还原酶活性[19]。
1.4 其他生理作用
硒还可调节维生素的吸收，参与辅酶A和辅酶Q的合成，增强糖代谢和生物氧化作用，促进蛋白质的合成。硒作为5'-碘化甲腺氨酸脱碘酶的组成成分，可使甲状腺激素由低生物活性的T4（四碘甲腺原氨酸）转化为高生物活性的T3（三碘甲腺原氨酸），并促进生长激素的合成与分泌，加速动物的生长。硒能维持胰腺的完整性，对脂肪的乳化、吸收和存留起一定作用。硒是精子线粒体外膜硒蛋白的组成成分，能促进精子形成，增强其活性，从而提高生育能力，动物缺硒时，雄性精子生成减少，活力下降，雌性受胎率降低，胎衣滞留，子宫炎的发生率升高[4，8]。
2 富硒酵母的生产
通过生物富硒将无机硒转化为有机硒，是生产富硒食品的一种安全有效的方法，而富硒酵母的生产是迄今最常用、最简便的一种生物富硒途径。富硒酵母一般含硒500~1 500 μg/g，其中有机硒占95%左右，主要以硒代氨基酸和硒蛋白的形式存在，少部分形成硒多糖和硒tRNA[20]。
2.1 培养基中硒浓度对富硒酵母生产的影响
培养基中硒的浓度对酵母的生长和硒的吸收有很大的影响，在酵母菌的培养过程中，一般会经历适应期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。由于硒是在酵母生长繁殖的过程中掺入到初级代谢产物中的，因此对数生长期是硒元素吸收富集的最佳时期，到了稳定期以后，酵母的生长基本停止，代谢降低，乙醇等发酵产物开始积累，硒很难再掺入到细胞内。由于酵母细胞在对数期吸收硒的能力显著高于其它生长阶段，故在进入对数生长期前应添加无机硒。但是，高浓度的无机硒对酵母细胞具有一定毒性，特别是在适应期,由于酵母细胞数量少,对外界环境的变化比较敏感,添加的硒量不能太多,一般认为30 μg/ml的无机硒可对酵母的生长起强烈的抑制作用。因此加硒以分批添加为好。虽然酵母菌种不同，对硒的耐受性也不同，但起始硒浓度一般不应高于25 μg/ml。在发酵中期硒的添加量可适当增加以利于硒的富集。当然，有条件的最好采取流加的方式，缓慢不断地流加低浓度无机硒。
陆建安等（2004）的研究表明，在发酵初期控制培养基中硒浓度在10 μg/ml水平，在对数生长期来临时，硒浓度提高至25 μg/ml,不仅能使硒酵母产量提高15.2%，而且还能有效地提高酵母细胞对硒的利用率，减少单质红硒沉淀的形成，使成品酵母有机硒含量达90%以上[21]。李爱芬等（2004）先将啤酒酵母培养2 h,使其处于对数生长期，在以后的8~9 h中采用流加的方法逐渐加入亚硒酸钠，酵母细胞中硒浓度可达1 200~1 900 μg/g[22]。
2.2 培养基成分对富硒酵母生产的影响
培养基成分对富硒酵母的生长和硒的转化也有很大的影响。麦芽汁是酵母菌生长繁殖的理想培养基，但麦芽汁的浓度过高会显著影响富硒酵母的得率。因为在含糖量较高的情况下（40 g/l，根据酵母菌种而异），即使在有氧的条件下培养，酵母的呼吸作用也会被部分抑制，从而促使可发酵性糖发酵生成乙醇（克拉勃脱效应）[23]。因此在常规培养时，最好将麦芽汁稀释至糖浓度在4°Bx左右，并适当补充氮源以利蛋白质合成。若要进行高密度酵母培养，最好用流加培养基的办法进行连续发酵或补料分批发酵。
除了麦芽汁外，富硒酵母还可以用各种合成或半合成培养基来进行培养。在（硒代）甲硫氨酸和半胱氨酸的合成过程中，硒的掺入相对于硫来说无任何优势，因此在设计培养基时，在保证酵母不被抑制的前提下应适当增加硒的浓度，同时还应尽可能减少硫的含量，使硒在代谢过程中具有竞争优势，以增加硒代氨基酸的合成比例。
在碳源的选择上,各地可因地制宜选择一些廉价的糖类,如甘蔗糖蜜、淀粉水解液等。美国FDA(2007)对饲用富硒酵母是这样定义的:富硒酵母是指通过补料分批发酵方式培养的无活性干酵母,在发酵过程中逐渐加入甘蔗糖蜜与亚硒酸盐,以使亚硒酸盐对酵母生长速度的不利效应降到最低,并保证无机硒最佳地结合到酵母细胞的有机质中。残留的无机硒经冲洗程序去除,使其含量不超过富硒酵母终产品总硒量的2%。
2.3 通气搅拌对富硒酵母生产的影响
由于酵母菌是一类兼性厌氧微生物，在有氧条件下生长繁殖，而在缺氧条件下进行发酵。为了得到大量的富硒酵母菌体，培养时必须提供充足的氧气，最好在发酵罐内进行通气搅拌培养。实验室条件下小规模制备硒酵母时也可用摇瓶培养，此时培养基装量以不超过1/5为宜（500 ml三角瓶中装100 ml培养基），摇床转速以200 r/min为好。
2.4 培养时间对富硒酵母生产的影响
在硒酵母的生产过程中，培养时间太短会导致酵母数量过低，时间太长则会导致菌体的死亡及自溶，而且还会降低设备利用率，增加成本。对于富硒酵母这类以菌体为主要培养目标的发酵，以稳定期的初期收获比较好。因此在进行正式发酵之前，有必要对所用酵母菌在选定的培养基中作生长曲线的测定，以确定最适培养时间。
3 富硒酵母中硒的存在形式
一个酵母细胞理论上能够结合的最大硒量依赖于细胞中甲硫氨酸和半胱氨酸（残基）的含量，大约为6 000 mg/kg。然而，硒代氨基酸完全替代甲硫氨酸和半胱氨酸是不可能的，这不仅是因为培养环境中存在着与硒起竞争作用的硫，更主要的是由于硒代半胱氨酸的掺入需要特异的条件[3]。在谷胱甘肽过氧化物酶分子中，存在着2个半胱氨酸残基，只有活性中心（第35位）的那一个可以被硒代半胱氨酸取代，而且取代后酶活性大幅度提高，另一个半胱氨酸残基不能被取代，说明生物能特异地识别硒代半胱氨酸的密码子，已有证据表明，硒代半胱氨酸是由UGA介导插入到蛋白质中的，UGA在一般情况下是作为蛋白质翻译的终止密码子存在的，但如果在mRNA分子上有一独特的茎环结构，环境中又有携带硒代半胱氨酸的特异tRNA(tRNAsec)和特殊的肽链延伸因子,UGA就作为硒代半胱氨酸的密码子参与蛋白质的合成[3]。因此并非所有半胱氨酸残基中的硫都能被硒所取代。一般而言,酵母中所能达到的最大硒量约为3 000 mg/kg,而普通商业富硒酵母中硒含量一般为500～2 000 mg/kg[24]。
富硒酵母中有机硒含量可达总硒量的90%以上，大部分以硒代甲硫氨酸的形式存在，游离的硒代半胱氨酸含量很少，因为生物细胞具有一套复杂而精细的调节机制，限制（硒代）半胱氨酸的过渡积累，以避免引发Fenton反应而产生大量自由基。Yoshida等(2002)的分析表明，富硒酵母中的硒有74.8%以SeMet的形式存在，9.9%以SeCys的形式存在，亚硒酸盐占5.1%，另外10.2%为三种未知的含硒化合物[25]。纯化的SeMet是不稳定的，易发生氧化，而酵母细胞中的SeMet相当稳定，室温贮藏10年之久的富硒酵母中SeMet仍是其主要的存在形式。Szulc等（2003）用阿累乌尼斯公式进行了预测，25 ℃的货架温度下硒酵母的稳定性可达1 126 d以上[26]。
4 富硒酵母的食用安全性
对于许多哺乳动物而言，甲硫氨酸是必需氨基酸之一，也就是说，动物本身合成甲硫氨酸的能力有限，需要从食物中得到补充。因此，如果在动物饲料或食品中直接添加无机硒，其生物利用率往往很低。而植物和微生物能将无机硒转化成硒代甲硫氨酸和硒代半胱氨酸，因此硒的生物学利用率要优于亚硒酸盐中的硒。酵母因培养方便，生长速度快，是优先选择的硒补充形式，77Se标记试验显示硒酵母中硒的吸收率可达75%~90%。另外，亚硒酸钠主要是通过单纯扩散的方式吸收，在高摄食下具有一定毒性，促进氧化反应的发生；而硒代甲硫氨酸(SeMet)是通过甲硫氨酸转运系统主动吸收的，几乎没有毒性[27]。富硒酵母对大鼠的LD50为37.3 mg/kg，远高于亚硒酸钠的5 mg/kg[4]。富硒酵母用作饲料添加剂或用于食品添加剂（在合理的剂量范围内）已有30多年的历史,至今还未见有硒中毒事故的报道。Clark等（1996）对人进行的补硒双盲抑癌干预试验也表明,每天补充200 μg富硒酵母,平均服用4.5年,没有出现任何副作用[13]。欧盟食品安全局专家小组对富硒酵母作为饲料添加剂的安全性和生物效率进行过评价,结果显示,在最大允许使用量（0.5 mg硒/kg饲料）下对所有喂饲动物均无副作用，而且不会改变环境中硒的浓度和分布，因此他们认为没有必要对富硒酵母进行专门的市场监控。但考虑到富硒酵母中还存在着一定量的无机硒，为了谨慎起见，美国FDA（2007）规定，富硒酵母作为饲料添加剂应以预混料的形式添加于鸡、火鸡、猪、肉牛与奶牛的全价饲料中，其饲料中硒的水平不超过0.3 mg/kg；若添加于肉牛的饲料补充物中，则肉牛每头每天的硒摄入量不超过3 mg[28]。
5 硒的测定方法
硒的测定方法很多，有分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、分子荧光法、极谱法、质谱法、电化学分析法、化学发光分析法、原子吸收法、电感偶合等离子光谱法等。无论哪种方法，测得的都是无机硒的含量，若要测定有机硒的量，可将样品消化后测定出总硒量，然后减去无机硒量即可。在这些方法中，以分光光度法、荧光法和原子吸收法较为常用。
5.1 分光光度法
利用特定化学试剂和硒结合后的颜色变化与硒浓度成正比这一特性进行定量分析的方法。贺立东利用硒能与3，3'-二氨基联苯胺在pH值2～3的溶液中反应形成稳定络合物的原理，通过甲苯萃取，测定络合物的吸光度（420 nm），根据标准曲线计算出硒酵母的硒含量[29]；郝素娥（1999）利用硒能够催化KClO3氧化苯肼生成偶氮离子，继而与变色酸偶合成红色偶氮染料这一原理，用催化吸光光度法（520 nm）测定硒酵母中硒的含量[30]。这些方法虽然测定相对容易，不需要特别的仪器，但灵敏度低，常需要有机溶剂萃取后测定，误差比较大。
5.2 荧光法
是现行国家标准中食品硒含量的替代测定方法。将样品用混合酸消化，使样品中不同形态硒转化为四价硒，利用酸性条件下四价硒能与2，3-二氨基萘（DAN）反应生成4，5-苯并苤硒脑这一特性，用环己烷萃取后于激发光波长376 nm，发射光波长520 nm处测定荧光强度，根据标准曲线计算出样品的硒含量。荧光法灵敏度高（检出极限为0.003 mg/kg）。是测定硒的经典方法，但所用试剂有毒，反应条件苛刻，操作较为繁琐费时。
5.3 氢化物原子荧光光谱法
近年来，氢化物原子荧光光谱法的研究取得了很大进展，已成为2003年版国标中食品硒测定的推荐方法。样品经酸加热消化后，将其中的六价硒还原为四价硒，然后用NaBH4（或KBH4）作还原剂，在盐酸介质中将硒进一步还原成SeH2，由载气（氩气）带入原子化器中进行原子化，在硒特制空心阴极灯照射下，基态硒原子被激发至高能态，在去活化回到基态时，发射出特征波长的荧光,其荧光强度与硒含量成正比[31]。氢化物原子荧光光谱法操作简便，准确度高，灵敏度好，共存元素干扰小，所用试剂毒性小，是目前最有效的测硒方法。该法有机硒和无机硒的最低检出浓度均为0.003 mg/kg，定量测定范围为0.01～4.00 mg/kg。
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（编辑：王 芳，）
刘杰，浙江大学生命科学学院微生物所，310058，浙江省杭州市西湖区余杭塘路388号。
徐林，浙江楠溪江啤酒有限公司。
吴根福，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-09-18
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