邓其兰 余 冰 陈代文
摘 要 NOD2蛋白是一种新发现的细胞内模式识别受体，可识别细菌细胞壁的肽聚糖及其裂解产物胞壁酰二肽，广泛参与宿主对病原体的免疫应答，是联系天然免疫与特异性免疫的重要桥梁。本文在查阅、总结近年来NOD2相关研究报道的基础上，介绍了NOD2识别的配体及识别方式、NOD2信号转导通路及信号转导调控，及与NOD2相关的肠道免疫损伤等方面的研究进展。
关键词 细胞内模式识别受体；NOD2；信号转导；肠道损伤
中图分类号 Q244
天然免疫系统是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线，宿主细胞对入侵病原体的识别是依靠表达在细胞表面或活细胞内的能够识别病原相关分子模式的模式识别受体介导。NOD(nucleotide binding oligomerzation domain)是一类存在于胞浆内的含有核苷酸结合寡聚化结构域的可溶性蛋白家族，广泛存在于植物、线虫、脊椎动物和人类的胞内，在遗传上高度保守。研究表明，NOD2能识别细菌细胞壁肽聚糖（peptidoglycan，PGN）的裂解产物胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP），广泛参与细胞内病原微生物的识别和炎症应答，是联系天然免疫与特异性免疫的重要桥梁。
1 NOD2的结构与分布
NOD2蛋白由3个不同的功能结构域组成:N端2个胱天蛋白酶募集区域（caspase recuriment domain，CARD），中央的核苷酸结合寡聚域（NOD）和C端富含亮氨酸的重复序列（leucine-rich repeats，LRR）。其中，CARD位于氨基酸残基22～28处，是一个蛋白质-蛋白质相互作用的区域，可与具有该模体的其它分子发生同源性相互作用，主要与下游的效应分子结合有关，其完整性对于NOD2介导的核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化是必需的。NOD结构域位于氨基酸残基273～577处，包含P环（P-loop，Walk A Box）和Mg2+结合位点（Walker B Box），可介导NOD2分子的自身寡聚反应。LRR位于氨基酸残基744～1 020处，含有α螺旋及β折叠，形成马蹄形结构，在配体识别过程中发挥着重要作用。如果缺乏LRR域，则NOD2对细菌配体无应答，因此是配体结合位点[1-4]。
NOD2蛋白呈限制性表达模式，在机体中主要表达于单核细胞、树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞、成肌纤维细胞，在肠道上皮细胞中表达较低。最近研究发现，NOD2在前脂肪细胞系3T3-L1及啮齿类动物的肠系膜前脂肪细胞内也有少量表达[5]。
2 NOD2的配体及配体识别
2.1 NOD2识别的细菌配体结构
NOD2位于胞浆，通过C端LRR域识别MDP配体参与胞内菌的识别并诱导炎症反应，因此MDP（即MurNac-L-Ala-D-isoGln）是NOD2识别细菌PGN模体的基本结构。NOD2能够且只能够识别MDP-LD而不能识别其异构体MDP-LL、MDP-DD，也不能识别M-TriDAP、M-TetraDAP。但是，NOD2能识别与MDP结构相似的M-Di、M-TriLys、M-TriOrn。
2.2 NOD2识别配体的亚细胞定位
研究表明，在肠上皮细胞中NOD2识别MDP需要定位于细胞膜，这种膜靶向定位对于MDP激活NF-κB是必需的，由NOD2 C端的2个亮氨酸残基和一个含色氨酸的模体所介导[6-7]。
Kufer等[8]报道称,膜结合的NOD2能够在细胞膜上对MDP发生应答并且激活NF-κB途径,NOD21007FS突变体则不能。NOD2需要将RICK（即RIP2）募集到细胞膜上来调控NF-κB信号途径和促炎因子的产生。同时，该学者还发现NOD2在基底外侧膜的定位并不受Erbin siRNA的影响，这就否定了Erbin将NOD2锚定在细胞膜的作用。
MDP渗透细胞的能力很弱。Vavricka等[9]发现，在结肠上皮细胞，MDP-LD可被一种二肽/三肽载体hPepT1摄取转运，同时它可竞争性抑制hPepT1对甘氨酰甲基甘氨酸的摄取。而siRNA可减少hPepT1的表达，抑制甘氨酰甲基甘氨酸和MDP的摄取。这提示在结肠上皮细胞hPepT1可能是MDP的转运载体。
3 NOD2的信号转导通路
3.1 MDP-NOD2-RIP2-IKK-NF-κB-靶基因
这条途径可认为是MDP诱导NOD2信号转导的经典途径。正常情况下，NOD2的C端LRR回折到自身蛋白的其它活性部分，当其靠近NOD域时，阻断了NOD蛋白寡聚体的形成，使得NOD2蛋白在胞浆内通过自我抑制的方式处于失活状态。当LRR与MDP结合后，暴露出NOD域，蛋白分子间通过NOD域相互作用发生寡聚化形成受体复合体。随后，受体复合体通过嗜同种CARD-CARD相互作用将受体相互作用蛋白-2(RIP2)分子募集到周围，激活RIP2。RIP2也称为RICK，活化后其CARD域与激酶域之间的中央区域与IκB激酶(IκB Kinase，IKK)γ亚基相连接，使后者发生泛素化后，继而引起IκB磷酸化降解，激活NF-κB核易位及含κB位点的靶基因转录，诱导产生一系列炎症介质，参与宿主抵御入侵病原的天然免疫反应[10]。
3.2 MDP-NOD2-RIP2-MAPK-JNK/Erk/p38-靶基因
McDonald等[7]研究表明，MDP诱导的NOD2信号还可通过激活MAPK进行转导。经NOD2活化的RIP2可激活MAPK，继而刺激JNK、Erk和p38，活化下游特异性转录因子AP-1、SRF和CREB等。后来，Kanneganti等[11]也证实了NOD2信号转导存在MAPK途径。
3.3 MDP-NOD2-Caspase-1-靶基因
有报道称，NOD2激活Caspase-1依赖于NALP1（NOD样受体家族中的另一成员）[12]。最近研究发现NOD2可通过其N端CARD域和Caspase-1的CARD域发生结合，直接活化Caspase-1[13]。Rosenzweig等[14]通过体内研究也发现，NOD2可通过caspase-1诱导IL-1β生成，引起小鼠眼睛发炎。这种炎症并不是由IL-1β的信号途径引起的，表明caspase-1由NOD2而非NALP3激活。
4 NOD2信号通路的调控
4.1 NOD2信号通路的正调控
可认为凡是NOD2信号转导途径中涉及到的不可或缺的因子都对其具有正调控作用。研究表明，RIP2缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞的NOD2不能激活NF-κB，当加入外源性RIP2后，NF-κB活性恢复[15]，这说明RIP2对于NOD2激活NF-κB是必需的。后来,Yang等[16]证实NOD2介导的NF-κB活化需要Tak1、E2交联酶Ubc13和E3泛素连接酶Traf6的参与。也有研究发现，Tak1(一种转化生长因子活化激酶)能够与NOD2相互作用，Tak1缺失会完全终止小鼠角质化细胞中MDP-NOD2的信号转导，提示Tak1也是NOD2介导NF-κB活化所必需[17]。Abbott等[18]推测RIP2可能是通过活化E3泛素连接酶或抑制K63去泛素化酶来使IKKγ亚基发生泛素化。
NOD2信号途径的下游效应分子NF-κB对其具有正调控作用。Gutierrez等[19]发现在人类髓单核细胞和上皮细胞中NF-κB活化可上调NOD2基因的表达，蛋白表达水平增加又反过来激活NF-κB，形成一个正反馈环路。
后来,Barnich等[20]发现了一个NOD2的相互作用蛋白GRIM-19(一种核蛋白),它与NOD2在胞质中共区域化、特异性结合。在过表达NOD2的HEK293细胞中,使用特异性siRNA干扰减少GRIM-19的表达,减少了MDP-LD诱导的NF-κB活化。同时,NOD2的抗微生物活性也依赖GRIM-19的存在,提示GRIM-19是NOD2介导的黏膜天然免疫应答的重要组成成分。另外,TREM-1(骨髓细胞表面的一种触发受体)可诱导NOD2的表达,增强细胞对低浓度MDP的应答反应[21]。
一些NOD样受体家族中的其它成员在信号转导中与NOD2具有相互促进效应。如Hsu等[13]研究发现，NALP1增强了HEK293 T细胞中NOD2对MDP产生应答、刺激IL-1β分泌的能力，同时NOD2也可促进NALP1结合到caspase-1上。
4.2 NOD2信号通路的负调控
Rac1和β-PIX都是NOD2的下游效应分子，可负向调控NOD2依赖的IL-8的分泌，并且和Erbin一起介导NOD2在细胞内的转运，因为Rac1和β-PIX表达下调可抑制NOD2在细胞膜上的募集[22]。
此外，研究者们鉴定出了几个新的NOD2信号负调控蛋白。McDonald等[7]筛选出的Erbin蛋白能与NOD2特异性结合，阻断NOD2下游的信号传递及前炎症细胞因子的产生。这一结论已在后来的研究中得到了证实[8]。Weichart等[23]发现，在HEK293细胞，MDP刺激导致了PRDX4（一种抗氧化酶）持久转录和蛋白质表达上调，而PRDX4基因敲除可明显增强MDP诱导的NF-κB转录，由此推测NOD2介导的PRDX4可能是NOD2活化NF-κB的下游负反馈环路的组成部分。Yamamoto-Furusho等[24]发现CENTβ1(一种GTP激酶活化蛋白)能与NOD2在胞质中共区域化并发生特异性结合,下调NOD2依赖的NF-κB活化。CD147是一种负调控NOD2的跨膜糖蛋白,可能通过与RIP2竞争NOD2的CARD域来影响NF-κB的活性[25]。
研究发现，NOD2蛋白的一些内源性转录剪接异构体对其信号转导也具有调控作用，NOD2 RNA可通过多种形式进行选择性剪接。Rosenstiel等[26]鉴定出一个内源性的NOD2抑制物NOD2-S，NOD2-S是由NOD2的转录剪接异构体编码的一个截短的NOD2蛋白异构体，可与RIP2和NOD2的CARD结构域相互作用，抑制NOD2/RIP2诱导的NF-κB活化。因此，NOD2转录产物的选择性剪接，可能是改变或下调NOD2识别细菌的活性的一种潜在机制。
最近研究发现，一些植物提取物对NOD2的信号转导也具有调控作用。Huang等[27]研究发现姜黄（多酚类物质）抑制了由配体诱导的NOD2信号转导，从而抑制了NF-κB的活化和靶基因IL-8的表达。
5 NOD2相关的肠道损伤
NOD2在肠道上皮细胞中的表达较低，这可能是机体对肠道正常微生物的一种保护机制。外源微生物入侵时，机体可能通过其它模式识别受体激活NF-κB、上调NOD2的表达，启动其介导的信号通路。
正常情况下，NOD2可通过其下游靶基因表达产物发挥病原防御、抗炎作用。如NOD2的下游靶目标DMBT1（一种粘膜免疫排斥因子），可防止细菌侵入小肠上皮细胞[28]。NOD2也可通过调控肠道Paneth细胞释放防御素和抗菌肽来维持肠道粘膜正常的屏障功能[29-30]，或者与CD147形成CD147-NOD2复合物降低CD147的活性，因为CD147高表达会促进李斯特菌（一种侵入细胞内的致病菌）侵入上皮细胞[30]。
NOD2在肠道免疫中具有重要作用，其基因突变会引起克隆氏病（Crohn's disease，CD）、Blau综合征(Blau syndrome，BS)和早发性肉样瘤（Early-onset sarcoidosis，EOS）等慢性炎症疾病。CD是由于编码LRR结构域的基因发生移码突变，NOD2介导的信号减弱引起；BS和EOS是由于编码NOD结构域的基因发生错义突变，NOD2信号转导失去调控引起[4]。
但是近来的研究表明，NOD2基因突变只是使肠道处于病原菌易感状态，是疾病发展的促进因素，而非直接发病因素。如Wehkamp等[29]发现NOD2-缺失小鼠虽然对李斯特菌的易感性增加，但肠道病理特征正常。NOD2基因突变或功能缺陷导致肠道免疫屏障受损，可能是由于抗菌肽表达量减少、防御素表达缺乏调节、肠粘膜渗透性增加等原因，使得肠道杀菌能力减弱、细菌易于侵入上皮细胞。
6 结语
NOD2作为细胞内的模式识别受体，是哺乳动物天然免疫中重要的识别系统。但是，目前关于NOD2的研究还不十分透彻，如细菌PGN或者MDP到底通过何种方式进入细胞内，NOD2又是怎样识别配体的，及NOD2具体的信号转导途径。因此，进一步探讨并阐明NOD2的信号转导途径及调控机理，将有助于我们更清楚地了解动物的发病机理、寻找有效的预防调控措施、制定科学的饲养管理方案。
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（编辑：刘敏跃，）
邓其兰，四川农业大学动物营养研究所，625014，四川雅安。
余冰、陈代文（通讯作者），单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-07-06
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