赵成萍 张 映
摘 要 试验对禽小脑膜胰多肽受体进行提取、纯化和鉴定研究，结果表明：加0.83 g正-辛基-β-D-葡萄糖（n-ctyl-β-D-glucoside）的提取产物，禽胰多肽受体的浓度最高为0.97 mg/ml，分子量为67 000。
关键词 禽胰多肽；受体；提取；纯化；鉴定
中图分类号 S816.79
Inui等人[1]1992年运用正-辛基-β-D-葡萄糖成功抽提了鸡小脑禽胰多肽受体(avian pancreatic polypeptide receptor，APPR)，并保持了其活性。发现APP受体是一种糖蛋白，分子量约67 000。为进一步研究禽胰多肽的生理、生化功能，我们对禽小脑膜胰多肽受体进行提取、纯化和鉴定试验。
1 材料与方法
1.1 试剂
PMSF（苯甲基磺酰氟，Sigma）、HEPES（N-2-羟乙基派嗪-N-2-乙磺酸，Sigma）、正-辛基-β-D-葡萄糖甙（n-ctyl-β-D-glucoside，Sigma）、卡介苗（太谷县防疫站）、羊毛脂、石蜡油、电泳试剂、sephandex G-50（Pharmacia）、DEAE纤维素-32（Whatman 进口分装）、硫酸铵、奈氏试剂、磺酰水杨酸、PBS、蛋白质标准（14 400～97 400 kDa，Pharmacia）、酶标兔抗鸡IgG （Sigma）、3，3-二氨基联苯胺（DAB，Sigma）、硝酸纤维素膜（NC，孔径0.45 μm，浙江黄岩化工厂）、明胶（中国医药公司采购供应站）。
1.2 仪器
高速冷冻离心机（Beckman）；JJ-2组织捣碎匀浆机（江苏国华仪器厂）；PHS-3C酸度计（厦门分析仪器厂）；紫外可见分光光度计（UV-9100，北京瑞利分析仪器公司）；B-2蠕动泵（上海统一生化仪器厂）；玻璃匀浆器；1 cm×50 cm层析柱。
1.3 禽小脑膜胰多肽受体的提取[3]
准确称取鸡小脑50 g，加250 ml冰冷的0.234 mol/l蔗糖，捣碎至匀浆液，2 100 r/min离心10 min，取上清液，4 ℃、18 000 r/min离心1 h，弃上清液，将沉淀悬浮于30 ml 50 mmol/l tris-HCl(1 mmol/l PMSF，pH值7.4)，用玻璃匀浆器于冰上匀浆3次，18 000 r/min离心1 h，弃上清液，将沉淀中加入50 mmol/l HEPES(1 mmol/l PMSF,1 mmol/l MgCl2，pH值7.4)至300 ml，4 ℃混匀，均匀分为3份（每份100 ml）。
将三份溶液中分别加入0.83 g、1.66 g和2.49 g n-ctyl-β-D-glucoside（浓度分别为0.83%、1.66%和2.49%）室温振荡45 min，4 ℃、18 000 r/min离心45 min取上清液，4 ℃保存备用。
1.4 禽胰多肽受体纯度的鉴定
用10%SDS-PAGE鉴定，安装好电泳槽后，按石继红等的方法[2]依次加完分离胶试剂，充分混匀（注意不可剧烈振荡，避免产生泡沫），迅速倒入两块玻璃板之间，静置30～60 min。等胶凝固后，以同样方法制备浓缩胶。浓缩胶倒至梳子1 cm处停止灌胶，迅速插上梳子，静置30 min凝固。浓缩胶凝固后，拔出梳子，小心加入电极缓冲剂直至没过胶面。取100 μl的样品和标准蛋白，分别加入等体积的样品溶解液，混匀后，沸水浴2～5 min，室温冷却后点样，每孔10 μl。电泳时开始电压为40 V，待指示剂进入分离胶后，调电压至60 V，恒压电泳直至指示剂距离底部0.5 cm为止。电泳完毕后，卸槽，将胶置于固定液中过夜，将固定液倒出，加染色液染色1.5 h，用蒸馏水冲洗4~5次后，再用脱色液脱色至蛋白区带清晰。用凝胶成像仪拍照，结果见图1。
1.5 禽胰多肽受体浓度的检测
采用经验公式法[3]，将经鉴定为纯品的样品稀释10倍，用紫外分析仪在波长260 nm和280 nm处分别测出吸光度值（A值），然后利用以下公式进行计算得出蛋白质浓度。
蛋白质浓度（mg/ml）=（1.45OD280-0.74OD260）×稀释倍数
2 结果与分析
2.1 禽胰多肽小脑膜受体纯度的鉴定结果
经10%SDS-PAGE鉴定，添加0.83 g n-ctyl-β-D-glucoside的提取产物分子量为67 000，与Inui的实验结果一致，且禽胰多肽小脑膜受体纯度高。而添加1.66、2.49 g n-ctyl-β-D-glucoside的提取产物则纯度低（见图1）。说明在整个APPR的提取过程中，表面活性剂n-ctyl-β-D-glucoside的浓度是关键。
2.2 禽胰多肽受体浓度的检测结果
经公式法测定和计算，禽胰多肽受体的浓度为0.97 mg/ml。
3 讨论
在禽胰多肽小脑膜受体的提取过程中，要注意温度是低温，否则影响实验结果。禽胰多肽小脑膜受体纯度以添加0.83 g n-ctyl-β-D-glucoside的提取产物纯度最高，禽胰多肽受体的浓度为0.97 mg/ml，而添加1.66、2.49 g n-ctyl-β-D-glucoside的提取产物则纯度低。说明在整个APPR的提取过程中，表面活性剂n-ctyl-β-D-glucoside的浓度是关键。
参考文献
1 Fuxe K, Agnati L F, et al. Intracisternal administration of avian pancreatic polypeptide lowers respiration rate and enhances the clonidine induced reduction of respiration rate in alpha-chloralose anesthetized rats: possible interactions with an alpha 2-adrenergic receptor. Acta Physiol Scand Jul,1982,115(3):381～384
2 石继红,赵永同,等.应用SDS-PAGE显示小分子多肽技术的探讨.生物工程进展,2001,21(1):38～41
3 王金胜,等编著.农业生物化学研究技术.中国农业出版社,2001
4 巩强.禽胰多肽受体的免疫组化研究.山西农业大学硕士论文，2004（编辑：刘敏跃，）
赵成萍，山西农业大学生命科学学院，030801，山西太谷。
张映，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2007-09-09
★ 山西省自然科学基金项目（20011090）和山西农业大学科技创新基金（2006009） |
相关信息
