吕 刚 张克英
摘 要 试验首先采用单因子设计研究了Alcalase（内切酶）单酶体外水解豆粕生产大豆肽混合物的适宜参数，结果表明：Alcalase水解豆粕的适宜条件为温度60 ℃，初始pH值7.9~9.0，反应时间4~6 h，酶水平0.012~0.024 AU/g豆粕；在单因素试验基础上，采用三因素二次回归正交组合试验设计研究了Alcalase、Flavourzyme联合使用水解豆粕的回归方程，结果为：Alcalase与Flavourzyme同时合用水解豆粕时，蛋白酶水平、水解时间与反应体系中TCA-NSI、NH2-N含量的二次回归方程是成立的。据此方程及生产实际成本，确定在温度50 ℃、未外加任何酸碱调节pH值条件下，适宜参数为：Alcalase 0.006~0.021 AU/g豆粕，Flavourzyme水平为2 LAPU/g豆粕，反应时间6~10.5 h，此时NH2-N含量8.807%~13.33%，TCA-NSI为31.66%~56.53%，平均肽链长集中在2~5个氨基酸残基。
关键词 豆粕；水解；肽；Alcalase；Flavourzyme
中图分类号 S816.32
豆粕因其蛋白质含量、消化利用率高而作为我国饲料生产中应用最为广泛的植物蛋白原料。但豆粕中存在一些抗营养因子(包括胰蛋白酶抑制剂以及大豆抗原蛋白)限制了其在幼龄动物(断奶仔猪、犊牛)和水生动物上的应用。应用发酵或体外酶解的方法提高豆粕的营养价值，从而替代或部分替代价格日益看涨的动物蛋白(如鱼粉、血浆蛋白)已成为一种趋势。这不仅因为体外酶解豆粕可一定程度的降低或消除豆粕中抗营养因子，更在于酶解过程中能产生大量的具有特殊营养生理功能的小分子大豆蛋白肽。本文探讨用蛋白酶来体外酶解豆粕生产大豆肽混合物，确定适宜的蛋白酶种类、水平和pH值等参数，并通过三因素二次正交回归试验研究了蛋白酶水平、反应时间与反应体系中三氯乙酸氮溶指数(TCA-NSI)、氨基氮含量(NH2-N)的量化关系，为将豆粕加工成为一种高品质蛋白源积累资料。
1 材料与方法
1.1 豆粕性状描述
豆粕颜色浅黄色，烤大豆香味，没有酸败、霉变、焦化等异味，呈不规则碎片状，不含过量杂质，粗蛋白46.1%（实测）。
1.2 酶的选择
Alcalase碱性蛋白酶来自丹麦NOVO公司，由枯草杆菌发酵而得，固态，适宜pH值偏碱性（依反应底物有变化），酶活3 AU/g，活性是以变性血红蛋白作为底物测定，是一种内切酶，主要用于提高蛋白水解程度；Flavourzyme来自丹麦NOVO公司，由米曲霉菌种经发酵而得，固态，适宜pH值中性偏酸性（依反应底物有变化），酶活500 LAPU/g，活性是以L－亮氨酸－对硝基苯胺为底物测定，同时含有内切酶和外切酶的复合酶，主要用于改善水解蛋白的风味。
1.3 试验药品及仪器设备
药品包括氢氧化钠、盐酸、三氯乙酸、亚铁氰化钾、乙酸锌、甲醛、甲基红、五水硫酸铜、硫酸钠等，均为分析纯。仪器设备包括150 ml锥形瓶若干、烧杯若干、碱式滴定管、酸式滴定管、pHS-3C精密pH计、HZS-H水浴振荡器、90-1型恒温磁力搅拌器、凯氏定氮仪。
1.4 测定指标及方法
粗蛋白含量（%)采用凯氏定氮法测定，参照杨胜(1999)的方法；氨基氮含量(NH2-N，%)采用甲醛法测定，参照黄晓钰和刘邻渭(2002)的方法；三氯乙酸(20%，V/V)氮溶指数(TCA-NSI，%)：TCA溶解氮/总氮。蛋白质水解度(DH，%)的测定：DH=(N2－N1)/(N0－N1)。
式中：N2——酶解后游离氨基氮含量(％)；
N1——酶解前游离氨基氮含量(％)；
N0——总氮含量(％)。
平均肽链长度（Average length of peptide chain, ALPC）：用肽段含有的平均氨基酸残基数表示（董玉莲等，2003）。
1.5 酶解方法及反应条件
精确称取2 g豆粕于锥形瓶中，加入20 ml双蒸水，振荡，然后按试验设计加入酶液，振荡，在试验设计的条件下反应，整个反应在水浴摇床中进行，摇床转速为120 r/min。反应结束后，加入20 ml 20%的三氯乙酸（V/V)结束反应，然后测定指标。
2 试验设计（见表1）
2.1 蛋白酶单酶酶解豆粕的适宜参数研究
2.1.1 Alcalase单酶酶解豆粕的适宜参数研究
采用单因子试验设计研究用Alcalase酶解豆粕的适宜水平、温度、pH值和时间。
2.1.1.1 Alcalase酶解的适宜pH值研究
分别在50 ℃和60 ℃条件下，研究了pH值对Alcalase酶解效果的影响。每个温度下均设6个处理，pH值6.6为对照组，为豆粕加蒸馏水的测定值，其余处理通过加NaOH调节pH值。反应条件：料：水=1：10，水解时间4 h，摇床转速120 r/min。
2.1.1.2 Alcalase酶解适宜水平及适宜温度水平的研究
通过三个单因子试验，分别研究了在pH值7.9， 温度50 ℃或60 ℃下，以及pH值6.6，温度50 ℃时，Alcalase的适宜水平。具体试验设计见表2。反应条件均为：料：水=1：10，水解时间4 h，摇床转速120 r/min。
2.1.1.3 Alcalase酶解适宜作用时间的研究
反应条件：A/S=0.048 AU/g，温度60 ℃，pH值控制在9.0左右，统一加入120 μl的氢氧化钠，料：水=1：10，摇床转速120 r/min，反应时间变化，设计梯度为（h）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、16.0。
2.1.2 Flavourzyme适宜水平的研究
试验设9个处理，研究Flavourzyme水平(0、1、2、5、10、20、30、40、50 LAPU/g豆粕)对酶解效果的影响。反应条件为：温度50 ℃，料：水=1：10，摇床转速120 r/min，没有外加任何酸碱（pH值6.6），反应4 h。
2.2 Alcalase和Flavourzyme合用酶解豆粕的适宜参数的研究
采用三元二次回归正交组合试验设计，在pH值为6.6时，研究同时添加Alcalase和Flavourzymem，酶水平和反应时间对酶解效果的影响，并建立回归方程。因素水平编码见表3。试验设计及实施方案见表4。
2.3 数据处理
正交回归试验采用Excel计算并建立回归方程，进行显著性、失拟性检验和统计选优，具体方法参考明道绪（2002）的研究。
3 结果与分析
3.1 Alcalase适宜pH值的确定（见表5、表6）
由表5可知，在50 ℃时，本试验设计pH值(6.6~9.0)范围内，Alcalase水解豆粕的TCA-NSI从pH值7.5到7.9有一个突跃，从25.674%上升到54.106%，而pH值从7.9变化到9.0，TCA-NSI没有明显的上升，说明从TCA-NSI角度，适宜初始pH值介于7.9~9.0之间。而DH变化趋势有所差异，在pH值7.9~9.0之间一直呈上升趋势。综合TCA-NSI、DH，50 ℃ Alcalase水解豆粕的适宜pH值为7.9~9.0。
从表6可知，60 ℃ Alcalase水解豆粕时获得最大TCA-NSI的初始pH值是9.40，而获得最大水解度(DH)生成的初始pH值仍然是9.40。而初始pH值从7.9变化到9.40时TCA-NSI增加幅度较小，实际生产中考虑成本可控制在7.9~9.0之间，可获得较大的TCA-NSI和较高水解度。
3.2 适宜温度的确定
对照表5、表6可发现，在相同的条件下，60 ℃时Alcalase对豆粕中大豆蛋白的水解能力强于50 ℃，提示60 ℃更加适合Alcalase酶活性的发挥。因为大多数在大豆蛋白上的研究显示，Alcalase的适宜温度介于50~60 ℃之间。因此本试验中选择了这两个梯度水平。3.3 适宜酶水平的确定
3.3.1 在50 ℃、初始pH值7.9时，Alcalase适宜水平的确定（见表7）
从表7可知，在50 ℃下，Alcalase水解豆粕时，本试验设定的范围内，TCA-NSI、NH2-N、DH随酶水平的增加单调递增，于TCA-NSI而言，Alcalase酶水平大于0.036 AU/g豆粕后，增加幅度相对变小，对NH2-N、DH而言，酶水平大于0.036 AU/g豆粕后，变化幅度较小，实际生产中考虑成本可控制在0.012~0.024 AU/g豆粕，可获得较大的TCA-NSI和较高的水解度。
3.3.2 在60 ℃初始pH值7.9时，Alcalase适宜水平的确定（见表8）
从表8可知，60 ℃ Alcalase水解豆粕时，其反应体系中TCA-NSI、NH2-N、DH随酶水平的变化趋势与50 ℃下一致，但酶解效率高于50 ℃条件下。实际生产中考虑成本可控制在0.012~0.024 AU/g豆粕，此时可获得较大的TCA-NSI和较高的水解度。
3.3.3 在50 ℃，初始pH值6.6时，Alcalase适宜水平的确定（见表9）
从表9可知，在pH值6.6时，在本试验研究的酶量范围内，随着Alcalase酶量的增加，TCA-NSI、DH一直呈现递增，但是增加幅度最为明显的是酶量小于0.024 AU/g豆粕，当酶量大于0.024 AU/g豆粕时，单位酶量所获得TCA-NSI、DH较小。实际生产中考虑成本可控制在0.012~0.024 AU/g豆粕，此时可获得较大的TCA-NSI和较高的水解度。
3.4 60 ℃、初始pH值6.6时，Alcalase酶解效果随反应时间的变化趋势（见表10）
从表10可知，60 ℃ Alcalase水解豆粕时随反应时间的延长，TCA-NSI、NH2-N、DH呈单调递增的趋势，但随反应时间的延长，单位时间内水解效率的增加幅度逐渐减小，实际生产中考虑成本可控制在4~6 h，可获得较大的TCA-NSI和较高的水解度。
3．5 Alcalase、Flavourzyme合用酶解豆粕时对水解效果的影响
Alcalase和Flavourzyme同时使用时，对酶解效果的影响见表11、降维分析分别见表12和表13。
3.5.1 氨基氮生成量与酶水平、水解时间的回归关系
① 氨基氮含量y(%)与x1、x2、x3的回归方程，其中：x1=(Z1-0.021)/0.010 6，Z1表示Alcalase水平(AU/g豆粕)；x2=(Z2-6)/2.829，Z2表示Flavourzyme水平(LAPU/g豆粕)；x3=(Z3-10.5)/6.718，Z3表示反应时间（h）。对建立的方程进行失拟性检验(P>0.05)，方程显著性检验（P<0.01）以及系数显著性检验，剔除系数检验F值小于1的回归项，决定系数R2=0.994 1。说明建立的方程拟和程度高，且选择的因素（水平）是恰当的，反应体系中的水解过程遵循三因素二次回归关系。
y=18.14+1.028Ax1+2.793Ax2+6.565Ax3+0.662ax1x3+1.237Ax2x3-0.432nsx22-1.041 5Ax32 （1）
根据此方程可以计算不同酶水平、水解时间时的豆粕水解液中的NH2-N含量，从而较好的反映豆粕水解液中大豆蛋白肽链的肽键被酶切割的程度，氨基氮含量高提示肽键被酶切割的数量更多，水解更彻底。由于水解度的变化趋势与氨基氮完全一致，仅仅在数字上大于氨基氮的含量，故本试验没有建立水解度的二次回归方程。但水解液中NH2-N含量与TCA-NSI可能不一致。
② 因素重要性采用降维分析法。将三元二次回归方程的另外两个因素固定在0水平，分别计算另一个因素取值（编码值）：1.414、1、0、-1、-1.414，氨基氮含量y的大小，结果见表12。y值变异系数越大表示因素对因变量y的影响越大，结果表明因素重要性顺序：时间>Flavourzyme>Alcalase。这提示我们在本试验的范围内，水解时间对于酶水解豆粕是最重要的因素，其次是Flavourzyme水平、Alcalase水平。在本试验条件下提高水解效率的最好办法是延长水解时间。
3.5.2 TCA-NSI生成量与酶水平、水解时间的回归关系
① TCA-NSIy（%）与x1、x2、x3的回归方程。对建立的方程进行失拟性检验（P>0.05）、方程显著性检验（P<0.01）以及系数显著性检验，剔除系数检验F值小于1的回归项。
y=62.769+7.032Ax1+4.411Ax2+11.788Ax3-1.340nsx1x3-1.888nsx12-4.426ax32（R2=0.959 4） （2）
② 同理采用降维分析法对因素重要性进行分析见表13，结果表明因素对TCA-NSIy（%）重要性顺序：时间>Alcalase>Flavourzyme。
4 结论
4.1 Alcalase单酶水解豆粕的适宜条件：温度60 ℃，初始pH值7.9~9.0，反应时间4~6 h，酶水平0.012~0.024 AU/g豆粕。
4.2 Alcalase与Flavourzyme同时合用水解豆粕，在温度50 ℃、未外加任何酸碱的pH条件下（即初始pH值为6.6），考虑到生产成本，确定适宜参数为：Alcalase 0.006~0.021 AU/g豆粕、Flavourzyme水平为2 LAPU/g豆粕，反应时间6~10.5 h，将参数代入方程(1)、(2)，得此时氨基氮含量8.807%~13.33%，TCA-NSI为31.66%~56.53%，平均肽链长集中在2~5个氨基酸残基。
（参考文献若干篇，刊略，需者可函索）
（编辑：崔成德，）
吕刚，四川农业大学动物营养研究所，博士，625014，四川省雅安市新康路46号四川农业大学9-4号信箱。
张克英，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2007-09-18 |
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