黄建龙 王 哲 张 才 刘国文
抵抗素是新近发现的一种由脂肪细胞分泌的富含半胱氨酸的多肽。人抵抗素基因定位于19p13.3,负责编码108个氨基酸残基组成的抵抗素蛋白。Tokushi确定了478 bp的牛抵抗素序列，具有完整的开放阅读框架, 负责编码109个氨基酸残基组成的牛抵抗素蛋白。这一序列同人的抵抗素cDNA 序列具有83%的同源性。
Steppan等对禁食隔夜的小鼠腹腔注射重组抵抗素,12 h后再注射一次,在2 h后测定葡萄糖耐量，发现血糖峰值升高28%,同时血浆胰岛素水平也升高。这说明外源性抵抗素导致的糖耐量受损,并非由于体内胰岛素分泌不足,而与胰岛素抵抗（IR）有关。后来的很多发现都证明抵抗素能引起IR, 肥胖、糖尿病和高脂血症等代谢综合征几乎普遍存在IR现象,但是抵抗素作用的分子机制仍不清楚。本研究旨在体外克隆出牛抵抗素（Resistin）基因序列,为进一步研究抵抗素的功能及对围产期奶牛能量负平衡的调控机制提供试验基础。
1 材料与方法
1.1 动物组织
选取临床检查无异常的新生1日龄犊牛1头，取其大网膜脂肪组织放入液氮中保存。
1.2 主要试剂
Tris购自Sigma公司；蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；乙醇、异丙醇、异戊醇、苯酚、氯仿、EDTA、NaOH、NaCl、Na2SO4·7H2O、琼脂糖均为国产分析纯；T4DNA连接酶、pfu高保真DNA聚合酶购自Promaga公司;焦磷酸二乙酯(DEPC)、反转录酶(AMV)、OligodT、PCR相关试剂和各种核酸内切酶购自TaKaRa大连公司；质粒DNA快速小提试剂盒、DNA片段回收试剂购自杭州维特洁生物技术公司；克隆载体(pMD18-T)购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存。
1.3 引物设计与合成
引物设计根据GenBank中牛Resistin mRNA序列设计牛Resistin引物。上游引物序列为ACGGATCCATGAAGGCTCTCTCCTT，5’端带AC保护性碱基和BamH I酶切位点；下游引物序列为GTCTCGAGCTGGATATGCAGGCGGC,5’端带GT保护性碱基和Xho I酶切位点,扩增的目的片段大小为343 bp,由上海生物工程有限公司合成。
1.4 大网膜脂肪组织总RNA的提取
取出冷冻在液氮中的大网膜脂肪组织标本，使用剪刀及镊子迅速切取30 mg脂肪组织，在液氮中反复研磨至粉末状,将粉末倒入1.5 ml离心管中。向离心管中加入1 ml Trisol试剂吹打混匀裂解细胞,加入200 μl三氯甲烷,剧烈振荡15 s，室温静止10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min,吸取上清液500 μl并移入另一洁净的离心管内，向管内添加500 μl异丙醇，轻轻混均,室温静止10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃去上清液，然后用75%乙醇洗涤沉淀的RNA，4 ℃、7 500 r/min离心5 min，最后用DEPC水溶解RNA。取5 μl的RNA溶液，加入上样孔，以5 V/cm恒压电泳（上样前先预电泳5 min），紫外光下观察总RNA条带质量并拍照。
1.5 RT-PCR反应
RT反应体系为25 μl: 总RNA 5 μl、5×RT Buffer 5 μl、dNTP Mixture 2 μl、Oligo(dT)18 5 μl、Rnase Inhibitor(RNA酶抑制剂)1 μl、AMV 1 μl,加无RNA酶的水至25 μl。RT反应条件为70 ℃、5 min，42 ℃逆转录90 min。
PCR反应体系为25 μl:10×PCR Buffer 2.5 μl、dNTP Mixture 2 μl、上游引物和下游引物各1 μl、cDNA 2 μl、pfu酶0.3 μl，加无菌水至25 μl。PCR反应条件为94 ℃预变性2 min、94 ℃变性35 s、59 ℃退火35 s、72 ℃延伸45 s、32个循环、最后72 ℃延伸10 min，-20 ℃保存。
1.6 牛Resistin基因的克隆
1.6.1 PCR产物的回收
将上述PCR扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳分析并照相，将目的片段所在位置凝胶切下，利用琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段,操作方法按试剂盒说明书进行。
1.6.2 PCR产物的连接
将纯化后的牛Resistin的PCR产物连接到pMD18-T载体上，取回收片断4 μl、10×连接 Buffer 1.5 μl、T4连接酶1 μl,用水补至15 μl,16 ℃连接10 h。
1.6.3 PCR产物的转化
取出制备好的DH5α感受态细胞，置于冰水浴中，加入连接物5 μl，用手指轻弹管壁，使其混合均匀，继续冰水浴30 min之后，42 ℃热冲击90 s，冰水浴2 min，然后将转化物涂于含有氨苄抗性(50 μg/ml)的LB平板上，37 ℃温箱过夜培养。
1.7 重组克隆质粒的鉴定
用质粒快速小提试剂盒提取质粒,先进行PCR鉴定,鉴定为阳性的克隆质粒用BamH I和XhoI双酶切鉴定。酶切体系为: 10×H Buffer 4 μl、BamH I和Xho I各1 μl、重组克隆质粒20 μl、用灭菌水补至40 μl,所有组分加完后混均,于37 ℃下温育2 h;酶切后取10 μl进行琼脂糖凝胶电泳分析。
1.8 序列测定
经PCR和双酶切鉴定阳性的重组质粒送上海生物工程有限公司进行测序,用DNAstar软件分析测序结果。
2 结果
2.1 新生犊牛大网膜脂肪组织总RNA电泳结果(见图1)
由图1可见，提取的总RNA有3条清晰的条带。说明提取的总RNA比较完整，然后测定其A260和A250值，RNA A260/A280值均大于1.9，说明达到反转录要求。
2.2 牛Resistin cDNA片断的RT-PCR扩增结果
对牛Resistin cDNA片断进行RT-PCR扩增,对PCR产物进行0.1%琼脂糖凝胶电泳(见图2)，在250～500 bp之间有一明显的条带,约为343 bp,与预期要扩增的Resistin基因大小相符。
2.3 克隆质粒PCR和酶切鉴定结果
挑取白色菌落接种到含100 mg/l Amp的LB培养基中, 提取质粒，经PCR扩增，在343 bp处有明亮的特异带。经PCR鉴定为阳性的重组质粒,用BamH I和XhoI 双酶切,电泳结果显示有约2 692 bp和343 bp的目的片段, 初步证明克隆成功(见图3)。
2.4 序列测定结果
将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒送上海生物工程有限公司进行序列测定。重组质粒的测序结果经DNAstar软件分析, 所得序列与设计序列的同源性为100%(见图4)。
3 讨论
3.1 抵抗素的生理功能
3.1.1 引起胰岛素抵抗
Steppan等最初命名抵抗素时就是因为它能引起胰岛素抵抗。Satoh等向雄性的Wistar鼠静脉注射一种由腺病毒编码的小鼠抵抗素,观察过度表达的抵抗素蛋白对胰岛素敏感性的慢性作用,结果显示，慢性的高抵抗素血症导致全身性胰岛素抵抗,从而导致糖耐量降低和高胰岛素血症。若给2型糖尿病模型动物注射抵抗素的抗体,胰岛素敏感性增强,从而降低升高的血糖。体外试验发现，3T3-L1细胞可分泌丰富的抵抗素进入培养基中,向3T3-L1细胞培养基中加入纯化的抵抗素IgG抗血清,监测[3H]-2脱氧葡萄糖在胰岛素刺激后的摄取水平，结果显示,脂肪细胞葡萄糖摄取能力提高42% ,而加入非特异性IgG抗血清的对照组,葡萄糖摄取能力无变化。
3.1.2 抑制脂肪组织的形成
Kim等用含有抵抗素基因表达载体转染COS细胞，再用相同条件培养液处理3T3-L1细胞后发现，培养基中3T3-L1细胞并未广泛地转变成脂肪细胞,有近80%的3T3-L1细胞被抑制；而在没有处理的培养基中,3T3-L1细胞可以分化为含有大量脂肪滴的成熟脂肪细胞。同时这些脂肪细胞标志物的表达，如过氧化物酶增殖体激活的受体、脂肪酸合成酶等比对照组低很多，提示抵抗素是一种抑制脂肪组织形成的反馈信号。
3.1.3 参与炎症反应
抵抗素水平在遗传性或饮食诱导的肥胖症中均升高, 同时出现脂肪组织中炎症因子的增加。并且体外试验发现,人抵抗素在外周血单核细胞中表达,在单核细胞分化获得巨噬细胞表型时,其mRNA水平较分化前增加了4 倍,提示抵抗素可能与单核巨噬细胞的功能有关。众所周知，单核巨噬细胞与炎症有关,因此,抵抗素可能与炎症有密切的联系。
3.2 牛Resistin的研究状况
随着对牛Resistin研究的不断深入,人们从分子水平上对其生物学功能及其调节机制有了初步的认识,但牛Resistin对糖、脂肪代谢及围产期奶牛能量负平衡的调控方面的研究尚未见报道。本试验从牛脂肪中提取总RNA ,成功地克隆牛Resistin基因343 bp的cDNA,为进一步研究牛Resistin的功能提供试验基础。（编辑：高 雁，）
黄建龙，吉林大学农学部畜牧兽医学院动物营养代谢病与中毒病研究室，130062，吉林长春。
王哲(通讯作者)、张才、刘国文，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2007-02-18
★ 国家自然科学基金项目（编号为30571365） |
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