张荣奎 刘爱花 贺淹才
张荣奎植酸酶(Phytase)是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称[1]。目前主要用于饲料工业和食品工业，用来消除植物性饲料或食品中植酸的抗营养作用，提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率，促进生长发育，提高动物生产性能，减少粪便中磷的排放量，降低磷对环境的污染[2]。大量研究表明,在猪、禽日粮中添加植酸酶, 可使饲料中磷的利用率提高40%～60%,粪便中磷的排出量减少30%～50%[3]。
植酸酶主要存在于植物和微生物中, 其中以微生物产生的植酸酶具有良好的开发前景, 但微生物天然菌株产酶水平较低,难以在生产中推广应用。利用分子生物学技术构建基因工程菌，提高植酸酶产量,从而降低生产成本,已成为世界性的研究热点之一[4,5]。 本文通过生物信息学方法拟对黑曲霉植酸酶基因进行序列分析，为该酶的改造研究提供参考。
1 植酸酶基因序列的研究
1.1 黑曲霉植酸酶基因PhyA序列分析
黑曲霉植酸酶基因PhyA序列全长1 506bp。其中+45bp～+146bp的102个核苷酸序列是一段典型的真菌内含子序列, 基因含有真菌内含子的特征保守序列[6]包括：供体序列(Donor)-GTATGC、套索结构(Lariat)-GCTGAC及受体序列(Acceptor)-CAG。黑曲霉phyA基因中的(G+C)%含量较高,达到52%,密码子第三位碱基的(G+C)%含量更高达62.7%。在密码子第三位碱基上高频使用G和C碱基是曲霉中高效表达蛋白编码序列所具有的特征之一[6]。
PhyA基因相应的氨基酸序列共有467个氨基酸残基，其中,根据VonHeijne的信号肽切割位点的预测原则，并结合已知的植酸酶氨基酸序列分析,信号肽切割位点位于第19个氨基酸残基之后,余下的448个氨基酸残基为成熟植酸酶的氨基酸序列。从氨基酸序列上还找到了植酸酶的活性位点序列(Active site sequence)——CRVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK[6]，它位于氨基酸序列的+71～+93bp，其中RHGARYPT是微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列。PhyA的晶体结构与鼠的低分子量酸性磷酸酶的晶体结构有很高的结构相似性, 说明PhyA属于组氨酸酸性磷酸酶家族。
1.2 黑曲霉植酸酶基因PhyB序列分析
PhyB基因序列全长1 861bp, 由4段外显子构成, 基因有一个PolyA尾信号。黑曲霉PhyB基因中的(G+C)%含量为56%左右，黑曲霉PhyB基因相应的氨基酸序列共有479个氨基酸残基，但起作用的为翻译产物的460个氨基酸。PhyB虽然也属于组氨酸酸性磷酸家族,有活性位点保守序列RHGERYP, 但核苷酸序列及编码的氨基酸序列与PhyA同源性较低,实际上它的最适底物不是植酸盐, 它仅是具有植酸酶活性的酸性磷酸酶。
2 植酸酶基因进化树分析
以丝状真菌植酸酶基因建立进化树（见图1）。从基因库中查找到黑曲霉植酸酶基因PhyA、PhyB、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉(A.Oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)等丝状真菌植酸酶的基因，应用BioEdit软件对这些植酸酶基因作进化树。由图1可知，黑曲霉植酸酶基因PhyA为肌醇六磷酸水解酶基因，而PhyB为具有植酸酶活性的最适pH值为2.5的酸性磷酸酶基因。它们之间的进化关系较远。黑曲霉的PhyA基因与米曲霉、土曲霉(A. aerrus)、构巢曲霉、烟曲霉、无花果曲霉(A.ficuun)等丝状真菌的植酸酶基因比较接近。而PhyB与O.proteus的PhyA2和绒毛栓菌(T. pubescens) 的PhyA比较接近。
研究发现，大部分丝状真菌的植酸酶基因PhyA之间进化关系较近，只有无花果曲霉的PhyA与其它丝状真菌phyA进化关系较远。而黑曲霉的PhyB与细菌植酸酶进化关系较近，与丝状真菌进化关系较远。植物植酸酶基因如玉米(Z.mays)的植酸酶基因和一些细菌, 如新月柄杆菌(C. crescentus)、沙雷氏菌(S. oneidensis)的植酸酶和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的phyC等的植酸酶基因进化关系较近, 而和丝状真菌来源的植酸酶基因相差较多，可见植物植酸酶基因主要由细菌植酸酶基因进化而来。新月柄杆菌、沙雷氏菌的植酸酶基因和枯草芽孢杆菌的PhyC比较接近，为中性植酸酶。大肠杆菌(E.coli)的appA、O. proteus的PhyA2、胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫病亚种(E. carotovora subsp. atroseptica)植酸酶和R.terrigena的 PhyK等细菌植酸酶基因之间进化关系较近, 和丝状真菌植酸酶基因进化关系较远。
3 黑曲霉植酸酶蛋白质的高级结构研究
3.1 植酸酶蛋白PhyA的高级结构研究
黑曲霉植酸酶PhyA是一种糖基化蛋白，糖基化含量为27.3%, 糖链中富含甘露糖，表观分子量约为85 000。因此，翻译出的蛋白质必须经过一系列的加工过程才能成为活性的成熟酶。糖基化能改变蛋白的一级结构，从而能增强酶的疏水性和钢韧性，提高耐热性，因此，糖基化对PhyA的生物合成和热稳定性至关重要。但是不同程度的糖基化也可能对蛋白质结构的稳定性及其功能产生一定的影响，糖基化也可能是提高植酸酶耐热性的原因。在PhyA中已发现了10个潜在的N糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr, X为任意氨基酸)。研究发现[7]，植酸酶PhyA的第297个氨基酸残基Arg对该酶的催化性质至关重要，分子模拟表明，该氨基酸残基直接作用于底物植酸的磷基团，推测是由于离子相互作用导致底物和产物紧密结合，从而降低酶的活力，成为反应产物释放限制步骤。
3.2 黑曲霉植酸酶蛋白PhyB的高级结构研究
黑曲霉植酸酶基因PhyB翻译产物为含460个氨基酸残基的蛋白质，糖基化程度不如PhyA高，分子量只有68 000。PhyB必须形成四聚体才具有植酸酶活性[8]，四聚体结构保证了PhyB的耐热性，但分开的单体不能再聚合成具有活性的酶，解释了PhyB在受热变性后很难复性的原因。
3.3 黑曲霉植酸酶的最适pH值等有关特性
黑曲霉植酸酶PhyA有两个最适pH值,分别为2.5和5.5, 最适温度为58℃,在37℃、pH值为2.5的条件下,以植酸钠为底物的Km值为50mmol/l。Ca2+对酶活性无影响,Mn2+、Co2+对酶有激活作用,能使酶活力分别提高30%和13%,Cu2+、Zn2+、Fe2+和Cu+对酶活性有抑制作用,其中前两种为非竞争性抑制,后两种为竞争性抑制。另外,一些对来源于动物、植物的酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如L(+)-酒石酸、磷霉素(Phosphomycin)对它却没有抑制作用。PhyA对植酸钠有很高的底物特异性，每毫克蛋白的比活力为105U, 是目前发现的比活最高的植酸酶之一, PhyA降解植酸磷生成的终产物分别是磷酸肌醇和无机磷酸。
PhyB只有一个最适pH值为2.5，并且在pH值为5.0时没有或者只有很少的活性，最适反应温度为63℃。PhyB对1,2-环己胺和苯甲酰甲醛有抗性，而 PhyA对它们很敏感。PhyB的Km值为103mmol/l，因此对植酸的专一性较差。
PhyA和PhyB结构和酶学性质具体差别数据见表1[9]。
4 应用与展望
黑曲霉植酸酶PhyA具有较高的酶活性，最适pH值为2.5、5.0，与其它丝状真菌来源的植酸酶相差较多，酶活性比其它丝状真菌来源植酸酶高，热稳定性也比较好。目前很多科研单位已经对该酶做了大量研究，对该酶基因结构和酶的性质已经很了解，主要通过改变其基因的(G+C)%含量, 提高在毕赤酵母等基因工程菌中的表达水平, 通过增加其糖基化位点来提高热稳定性以更适合生产, 并对酶的活性位点进行定点诱变，提高酶活性和特异性。黑曲霉植酸酶PhyB为含有4个亚基的蛋白质, 最适pH值为2.5左右。由于PhyB高温下变性后很难复活, 因此研究较少, 但是，国外一些科研机构对PhyB在某些基因工程菌中的表达进行了研究, 目前主要研究方向是改变酶分子中四聚体中亚基间的结合位点, 使其更稳定，适合生产要求。
综上所述,以植酸酶黑曲霉作为出发菌株, 采用基因工程技术研究开发饲用植酸酶产品所获得的基因工程菌, 所产酶活可达出发菌株的几十倍到上千倍。美国、芬兰、荷兰和德国的多家公司已推出了多种植酸酶制剂，我国已开展微生物植酸酶的有关研究工作, 主要研究工作集中在产酶微生物菌种筛选、诱变和酶活力测定等方面, 植酸酶的基因工程应用研究较少, 还没有利用基因工程菌生产植酸酶产品面市。因此, 利用基因工程技术对微生物植酸酶基因进行研究与开发，使我国自行生产成本低廉的植酸酶，对缓解我国磷资源的缺乏，降低饲料成本，减少磷对环境的污染,产生巨大的经济效益和社会生态环境效益。
参考文献
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2 Hurrell RF，Reddy MB, Juillerat MA, et al. Degradation of phytic acid in cereal Porridges improves iron absorption by human subjects [J]. Am. J. Clin. Nutr., 2003,77(5):1 213～1 219
3 王红宁，吴琦，刘世贵，等. 黑曲霉N25植酸酶PhyA基因的克隆及序列分析[J]. 微生物学报, 2001, 41(3): 310～314
4 彭远义, 刘生峰, 李春明, 等. 黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达[J]. 生物工程学报, 2004,20(6):967～971
5 Nickolay V. Zinin, Anna V. Serkina, Mikhail S. Gelfand, et al. Gene cloning, expression and characterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004 (236): 283～290
6 吴静,闫艳春.植酸酶基因工程的研究进展[J].中国畜牧兽医, 2004,31(1):12～15
7 Andrea Tomschy, Markus Wyss, Dirk Kostrewa, et al. Active site residue 297 of Aspergillus niger phytase critically affects the catalytic properties [J]. FEBS Letters, 2000(472): 169～172
8 朱海东, 周晓云, 王蓓, 等. 植酸酶的研究进展[J]. 饲料研究, 2005(1): 13～15
9 Abul H.J. Ullah, Kandan Sethumadhavan. Differences in the Active Site Environment of Aspergillus ficuum Phytase [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998(243): 458～462
（编辑：刘敏跃，），华侨大学材料学院，362021，泉州。
刘爱花、贺淹才（通讯作者），单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2006-02-20
★ 福建省自然科学基金资助项目（C04010011） |
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