|
常洪涛 郝华芳 陈 陆 杨 霞 王川庆
猪圆环病毒病（Porcine Circovirus Disease PCVD）是由猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)所引起的哺乳仔猪和育肥猪的临床或亚临床型传染病，被世界各国兽医界公认为目前最重要的猪传染病之一。PCV是迄今发现的最小的动物DNA病毒，有两个血清型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1无致病性，广泛存在于猪体内和猪的传代细胞系中；而PCV-2则具有致病性，可以引起猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、繁殖障碍、传染性仔猪先天性震颤、肠炎及间质性肺炎等，其中以PMWS危害最为严重。此外，PCV-2还与猪呼吸道疾病综合征（PRDC）有关。自1991年加拿大首次报道以来，包括我国在内的世界上许多国家和地区都报道有该病的发生。本病主要侵害5～18周龄仔猪，可引起淋巴系统疾病、渐进性消瘦、呼吸道症状及腹泻，并可侵袭猪的免疫系统，干扰和破坏机体对疾病免疫抗体的产生和维持，致使其抵抗力下降，从而容易继发或并发其他病原体，使疾病进一步复杂化。本试验采用无PCV污染的PK-15细胞，对河南省发生的具有PMWS典型临床症状和剖检特征，并且病料PCR检测为PCV-2阳性的病料进行了PCV-2毒株的分离和鉴定，以期获得PCV-2河南地方流行毒株，从而为探索PCVD的流行病学数据、相关疾病的致病机理、筛选疫苗毒株和制定综合防控措施提供依据。本试验成功分离到1株PCV-2，将其命名为JZ株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源
病料采自河南省许昌、焦作、新乡等地的求诊猪场，均为疑似感染PCV-2引起PMWS病死猪的淋巴结及脾脏。
1.1.2 细胞系
PK-15细胞由河南农业大学动物传染病实验室保存、提供。
1.1.3 主要试剂
十二烷基磺酸钠（SDS）饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、胰蛋白酶（华美生物工程公司）；rTaq酶、MgCl2、dNTP、10×Buffer、DNA凝胶回收试剂盒（TaKaRa公司）；蛋白酶K（德国MerKer公司）；D-氨基葡萄糖、DMEM培养基(大连宝生物工程有限公司)；超级新生牛血清（郑州佰安生物工程有限公司）。
1.1.4 主要仪器
倒置生物显微镜(德国LEICA公司)；MCO-175型CO2培养箱（日本三洋公司）；Universal 32R高速冷冻离心机（德国Hettich公司）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；ECP3000三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）；DYC3113型电泳槽（北京六一仪器厂）；PCR仪（Thermo Hybaid）；ZS-2200型凝胶成像仪（美国基因工程公司）等，均由河南农业大学动物传染病实验室提供。
1.1.5 引物的设计
根据已发表的PCV-1、PCV-2基因组全序列，利用计算机辅助软件Primer6.0设计型特异性引物。引物P1/P3预期扩增PCV-2长度为1 154 bp，引物P1/P2预期扩增PCV-1长度为652 bp。3条引物均由上海生物工程公司合成。
P1:5′-CCG CGG GCT GGC TGA ACT T-3′
P2:5′-CTC GGC TAT GCG CTC CAA AAT G-3′
P3:5′-ACC CCC GCC ACC GCT ACC-3′
1.2 方法
1.2.1 病料的采集与处理
将疑似PCV-2的发病猪进行剖检，观察并记录其病理变化。无菌采取剖检猪的淋巴结、脾、肺脏作为检测PCV-2的材料；在无菌操作台上用剪刀剪去脂肪、肌腱等，按1：5加入PBS液，无菌研磨，-20 ℃冻融2次，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，用于DNA模版的制备。
1.2.2 病料DNA的提取
取制备好的组织上清液加入等体积组织裂解液，加入蛋白酶K使终浓度为100 μg/ml，充分混匀后，置56 ℃水浴作用2 h;加入等体积的饱和酚,12 000 r/min、4 ℃离心5 min；取上清液加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1),12 000 r/min、4 ℃离心5 min；取上清液加入等体积的氯仿，12 000 r/min、4 ℃离心5 min；取上清液，加入1/10体积的3 mol/l NaAC，2.5倍体积的预冷（-20 ℃）无水乙醇，-20 ℃的冰箱过夜沉淀DNA，取出后12 000 r/min、4 ℃离心30 min，弃去上清液；用70%冷乙醇洗涤沉淀2次，自然干燥后以20 μl TE缓冲液溶解核酸，4 ℃消化核酸1 h，-20 ℃保存备用。然后进行PCR扩增。
1.2.3 PCR反应体系和条件
引物浓度为20 pmol/μl，dNTPs每种浓度为2.5 mmol/l，MgCl2浓度为25 mmol/l，rTap酶为5 U/μl，整个PCR反应体系为50 μl。反应成分如下：10×buffer 5 μl，dNTPs 4 μl,MgCl2 3 μl,3条引物各为1 μl,模板DNA 10 μl，rTap酶0.5 μl，加超纯水至50 μl，瞬时离心。将混合物95 ℃预变性10 min后，进入PCR循环，按94 ℃变性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
1.2.4 PCR产物的检测
取5 μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,以Marker DL-2000作为标准DNA分子量,紫外灯下观察扩增片段大小,并拍照记录结果。以出现1 154 bp条带的为PCV-2阳性,652 bp的为PCV-1阳性，如同时出现上述两条带则表示PCV-1与PCV-2均为阳性。
1.2.5 PCV-2的分离及PCR鉴定
将符合条件的病料用Hanks液稀释成1：5，研磨成匀浆,反复冻融3次后,12 000 r/min离心15 min，取上清液，用无菌的0.22 μm的滤器过滤。待PK-15细胞贴壁生长至半融合状态，弃去营养液，加入制备的组织病料上清液，37 ℃吸附1 h；加入10%的超级新生牛血清DMEM培养液继续培养；待细胞长成单层时，弃去营养液，加入适量终浓度为300 mmol/l的D-氨基葡萄糖，用PBS（pH值7.2）液洗涤细胞4次，加入2%的新生牛血清DMEM维持液继续培养。在用D-氨基葡萄糖作用后48～72 h，将细胞反复冻融3次，收集细胞病毒液，放置-20 ℃冰箱中保存。培养过程中同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照。病毒连续盲传5代，基本适应细胞生长。
2 结果与分析
2.1 临诊病料中PCV-2的检测结果
应用本实验室建立的复合PCR方法对来自河南省不同地区3个猪场的具有PMWS典型临床症状和剖检特征的病料进行了PCV检测，结果表明：许昌一猪场的病料仅感染PCV-1；新乡一猪场的病料同时感染PCV-1和PCV-2；而焦作一猪场的病料仅感染PCV-2（见图1），因此选择焦作病料用来分离PCV-2。
2.2 接毒前后PK-15细胞的生长状态
将长满单层的PK-15细胞（见图2）经胰蛋白酶消化分瓶后，待PK-15细胞贴壁生长至半融合状态（见图3），加入处理好的病料上清液吸附1 h；加入生长液，直至细胞接近生长单层（见图4）时，用D-氨基葡萄糖处理20 min；加入维持液培养48 h（见图5）冻存收毒。
2.3 病毒不同传代次数的DNA检测结果
病毒不同传代次数的检测结果见图6，盲传5代后病毒含量基本一致。
2.4 不同时间收获病毒的DNA检测结果
病毒接种细胞后，分别在24、36、48、64 h收毒。从图7可看出，在培养48 h后可检测出核酸，之后随着时间推移逐渐增多。
2.5 D-氨基葡萄糖处理前后病毒的DNA检测结果
在病毒培养过程中发现，使用D-氨基葡萄糖处理病毒比未使用其处理病毒含量明显提高（见图8）。
3 小结与讨论
3.1 近年来PCV-2的感染率在我国呈明显上升趋势，已成为危害养猪业的主要猪病之一，因该病毒的感染所导致的疾病使我国规模化猪场疫病的复杂程度加大，给养猪业带来重大的经济损失。由于猪圆环病毒能干扰猪的免疫系统，造成免疫抑制，引起继发性免疫缺陷，使猪只变得对多种感染十分敏感，多重感染或混合感染成为普遍的发病规律，导致猪群发病后临床症状更趋复杂。对该病的预防与控制，国内外尚无有效的措施。而分离地方毒株，可为研究其致病机理、筛选疫苗毒株和制定综合防控措施提供帮助。本试验成功的分离到1株PCV-2地方流行株，从而为进一步从分子水平研究PCV-2在河南省的流行、变异规律以及主要结构基因的特性等奠定了基础，也为PCV-2的诊断及预防奠定了良好基础。
3.2 PK-15细胞系是体外培养PCV-2的良好细胞系，把PCV-2接种到无PCV污染的单层细胞上能够增殖，但却不产生细胞病变。因为直接以病料接种细胞进行病毒的分离具有很大的盲目性，而本试验通过PCR方法对疑似病料进行PCV-2核酸检测，来确定该病料是否存在PCV-2感染，可明显提高病毒的分离率。
3.3 PVC-1是广泛存在于PK-15细胞中的非致病性污染物，这给PCV-2的分离纯化带来了困难，因而用复合式PCR方法可以快速鉴别出细胞是否被PCV-1污染。复合PCR是一种特殊的PCR技术，即在同一反应体系中加入多对引物，扩增多个基因片段。此法方便快捷，具有较高的敏感性和特异性，已广泛用于兽医学临床诊断。因此我们在同一体系中使用3条引物，从而达到PCR扩增1次就可检测鉴别PCV-1和PCV-2的目的。本试验成功地从病料和PK-15细胞培养物中扩增出了PCV-1和PCV-2特异的基因片段，表明建立的复合PCR方法可将无致病性的PCV-1和有致病性的PCV-2区别开来，从而为辅助临床诊断提供更加准确的依据，也为进一步研究PCV-2与“猪高热综合征”及其它疾病的相关性奠定了基础。
3.4 由于病料中存在很多毒性物质，在病毒分离时会严重影响细胞的贴壁生长。本试验在初次分离培养病毒时，病料上清液直接接种到经胰蛋白酶消化分瓶后的细胞中，使细胞和病毒同时生长，但培养18 h后细胞量很小，未能贴壁。经分析主要是在处理病料上清液过程中部分毒素未能清除，影响了细胞的生长。因而本试验对培养方法略作改进，即采用半融合状态的PK-15细胞接种病料上清液,待细胞长至接近单层后用300 mmol/l的D-氨基葡萄糖处理20 min，48 h后病毒获得大量增殖。因为这与D-氨基葡萄糖诱导细胞进入s期，促进病毒的增殖有关。研究表明，用D-氨基葡萄糖处理细胞，一方面可以增强细胞s期蛋白的表达，另一方面可以促进病毒DNA进入细胞核，从而增强病毒的增殖复制，据报道可使PCV2抗原阳性细胞数提高30%。经过盲传5代，JZ株在细胞中获得了良好的增殖。
3.5 对于PCV-2疫苗的研制，目前遇到的主要困难是病毒在体外培养的增殖能力不强，病毒细胞培养的含毒量难以满足制备疫苗的要求；其次是评价疫苗免疫的检测指标不易确定，强毒感染动物模型反应结果不一。而本试验分离的JZ株病毒在细胞上连续传5代后，仍可从细胞上检测出PCV-2,说明该毒株已经适应PK-15细胞，并使病毒产量能够有效提高，这为今后开展PCV-2疫苗免疫的研究奠定了基础。
（参考文献17篇，刊略，需者可函索）
（编辑：刘敏跃，）
常洪涛，河南农业大学牧医工程学院，讲师，450002，河南省郑州市文化路95号。
郝华芳、陈陆、杨霞、王川庆(通讯作者)，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-09-27
|
相关信息
