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王 清 曾 莹 王永泽 邵 进
摘 要 木聚糖酶作为饲料添加剂，可以强化禽畜消化道分解饲料的功能，促进营养物质的吸收。通过单因素试验和正交试验对黑曲霉A-3固态发酵生产饲用木聚糖酶的工艺条件进行了研究。优化的发酵条件如下：采用麸曲种子接种，接种量为10%；装料量为5 g/300 ml三角瓶、初始pH值为5.5、培养温度为35 ℃、料水比为1：1.5、培养时间为84 h。在优化条件下，菌株产木聚糖酶活力达8 291.75 IU/g，比优化前提高了63.73%。
关键词 饲用木聚糖酶；黑曲霉；固态发酵；正交试验设计
中图分类号 S816.7
半纤维素饲料中含有大量的抗营养因子非淀粉多糖（NSP），主要是木聚糖、β-葡聚糖、纤维素等。由于单胃动物缺乏相应的消化酶，因而不能消化吸收NSP，使谷物籽实中的营养物质不能被充分暴露于动物消化液的表面，并使消化道食糜粘度增加，导致饲粮养分消化率和饲养效果降低，从而制约了饲料的大量应用。研究发现绿色、无残留木聚糖酶的添加可将木聚糖降解成低聚糖和木糖，提高谷物类饲料养分的利用率，提高畜禽的生产性能，具有很好的社会效益和经济效益（邱利伟，2008；聂国兴等，2008）。
木聚糖酶(Xylanase)是指将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，是木聚糖酶降解酶系中最关键的酶。一个木聚糖分子的完全酶解主要需要β-1,4-内切木聚糖酶和β-木糖苷酶，前者从主链内部作用于木糖苷键，将木聚糖分解成低聚糖，而后者作用于木糖末端，释放出木糖(张晓军等，2005；张王照等，2005；Haltrich D 等，1996)。木聚糖酶之所以能消除NSP的抗营养作用，主要是NSP酶将NSP降解为小分子，从而改变NSP的抗营养特性(万红贵等，2008)。
由于木聚糖酶对NSP的降解能力，其在饲料添加剂中有着十分重要的地位。本文拟通过将农业废弃物以固态发酵的方式转化为酶制剂饲料添加剂，以较低的成本获得大量高活力的木聚糖酶。考虑到固态发酵影响因子较多，我们采用了正交试验设计对固态发酵工艺进行了优化。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种
黑曲霉（Aspergillus niger A-3）由湖北工业大学微生物学课题组经诱变选育并鉴定，该菌株具有2-脱氧葡萄糖抗性和Nystatin抗性，同时具有高产木聚糖酶的特性。
1.1.2 培养基
斜面培养基：蔗糖20 g、酵母膏10 g、蛋白胨10 g、琼脂10 g、水1 000 ml，pH值自然。
麸曲培养基：麸皮5 g、自来水5 ml，pH值自然。
产酶基础培养基：稻草粉40 g、玉米芯粉40 g、麸皮20 g、尿素3.5 g、葡萄糖0.5 g、Tween-80 0.1 g、ZnSO4 0.1 g、水100 ml，pH值自然。
1.1.3 试验材料与试剂
稻草和玉米芯分别用中草药粉碎机处理后过40目分样筛得到，麸皮为市购。
1.1.4 试验仪器与设备
722S型分光光度计、HHB11型电热恒温培养箱、CJ-ID型超净工作台、XSP-18A-显微镜、手提式压力蒸汽灭菌锅。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株活化
将黑曲霉菌株接入斜面培养基中,于30 ℃下恒温培养72 h。
1.2.2 麸曲种子制备
用接种环挑取三环孢子，加入麸曲培养基中，置30 ℃下培养48 h。
1.2.3 单孢子悬液制备
将活化好的菌种用9 ml无菌水（0.85%NaCl）洗下斜面孢子，浓度约为2×106个/ml。
1.2.4 固体发酵培养
将经选育的高活性饲用木聚糖酶产生菌黑曲霉A-3分别在不同的环境条件（接种方式、接种量、装料量、初始pH值、温度、加水量、培养时间等）下做单因素试验进行固态发酵培养，探讨产酶条件，最后在单因素试验的基础上采用正交试验法优化产酶环境条件。
1.3 木聚糖酶活力的测定
1.3.1 发酵粗酶液的制备
准确称取1 g固态发酵培养物，加玻珠约20粒，再加入30 ml 0.2% NaCl，在30 ℃ 180 r/min条件下浸提1 h，过滤，滤液即为粗酶液。
1.3.2 木聚糖酶活力测定
参照曾莹等（2003）方法进行。取0.1 ml适当稀释的粗酶液,用0.9 ml pH值4.6醋酸缓冲液配制的1%木聚糖作底物。40 ℃水浴加热10 min后加入2.0 ml 3，5－二硝基水杨酸试剂，沸水浴加热3 min，取出迅速冷却至室温，用纯水定容至25.0 ml，摇匀。用722S分光光度计在495 nm波长处测其吸收值。以相对应的100 ℃灭活的稀释粗酶液作对照。
木聚糖酶活力单位定义为：在pH值4.6，40 ℃条件下，每分钟水解木聚糖产生相当于1 μmol的还原糖（以木糖计）所需酶量（IU/g）。
2 结果与分析
2.1 产酶工艺条件的优化
从发酵环境条件的优化方面研究产酶菌株的最佳产酶条件，从而探讨菌株的产酶特性。
2.1.1 接种方式对产酶的影响
比较单孢子悬液接种和麸曲种子接种对产酶的影响。结果见表1。
由表1可知，用麸曲种子接种优于单孢子悬液接种。单孢子悬液接种周期为3 d,操作繁琐易染菌,不适合大规模生产；麸曲种子培养周期较短,只需要2 d，培养过程简便，且由于麸曲培养基成分接近产酶培养基，从而有利于更快进入产酶合成期，因此麸曲种子接种更适合于工业化生产。
2.1.2 接种量对产酶的影响
接种量过低，菌丝体生物量增长缓慢，产酶周期延长；接种量过高，则营养物质消耗过快，不利于木聚糖酶的合成，导致产酶量降低。因此选择适当的接种量很重要。分别向6瓶基础产酶培养基中接入0.5、1.0、1.5、2、2.5、3 g的麸曲种子，即接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%，30 ℃培养60～65 h。测定酶活力。结果见图1。
由图1可见，接种量为10%时酶活力最高，接种量大于10%或小于10%都不利于产酶。
2.1.3 装料量对产酶的影响
黑曲霉是好氧微生物，装料量影响通气量，对菌体的生长有很大的影响。当通气量不足时对菌体的生长代谢产生抑制作用，导致酶产量下降，而通气量过大又增加了生产成本，因此选择适当的通气量很重要。分别向6个产酶基础培养基中装入2.5、5、7.5、10、12.5、15 g固形物，置30 ℃培养60～65 h。结果见图2。
由图2可见，随着固形物装料量的增加，酶活力先上升后下降。在固形物装料量为5 g/300 ml三角瓶时酶活达到最高。这是由于当培养空间一定时，固形物增加，通气量降低，产酶受到影响。说明黑曲霉对氧气比较敏感。
2.1.4 初始pH值对产酶的影响
由于固态发酵物稻草、玉米芯和麸皮均具有较大的缓冲作用，如果采用缓冲液来调节培养基的初始pH值，会有很大误差，且改变了培养基中无机盐的浓度。因此选择采用盐酸或氢氧化钠来调节初始pH值5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，研究不同初始pH值对产酶的影响。结果见图3。
由图3可见，当培养基初始pH值为自然pH值即6.5时，酶活力最高，pH值为7.0时酶活力次之。说明在中性偏酸环境下更有利于菌株合成和分泌木聚糖酶。
2.1.5 培养温度对产酶的影响
培养温度的高低影响着微生物的生长繁殖，同时影响着其它代谢产物的形成和分泌。因此研究不同温度（28、30、32、35、37 ℃）对产酶的影响。结果见图4。
由图4可知，在35 ℃时酶活力产酶量最高，酶活力达9 023.99 IU/g 鲜曲。高于或低于35 ℃都不利于产酶。
2.1.6 料水比对产酶的影响
在固体发酵过程中，培养基的初始水分含量是影响菌株产酶的关键因素之一。水分的高低会影响到基质的透气性和菌丝生长状况，也会影响到代谢活动和目的产物的合成。高于最佳水分含量，将使麸皮的透气性降低，氧气输送量减少；而低于最佳水分含量将导致固态底物中营养物质的可溶性下降，而微生物也得不到足够的水分进行生长产酶。因此，在产酶基础培养基上，做35 ℃下的加水量比较。结果见图5。
由图5可见，35 ℃加水量为2.5 ml即料水比为1：1.5时产酶最佳，在此条件下酶活力最高。
2.1.7 培养时间对产酶进程的影响
测定产酶曲线有利于控制好生产中的发酵时间，提高有效物质产量。在产酶基础培养基上，分别在培养24、31、42、48、54、60、72、78、84、92、102 h的时候测木聚糖酶活力，结果见图6。
由图6可见，发酵24 h时，酶活力为111.30 IU/g 鲜曲；24～48 h酶量开始小幅度增加；48～60 h酶量显著增加，在84 h产酶量达到最高，木聚糖酶活力高达5 249.02 IU/g鲜曲；84 h后产酶量开始下降。由于在84 h时酶活力比60 h时的酶活力提高了5.13%，但培养周期延长了40%，有必要作为正交试验两个水平进一步比较。
2.2 正交试验
经过如上单因素考察，发现初始pH值、接种方式、培养温度和培养时间这4个因素对固态发酵产酶的影响很大，因此选取了这4个因素进行进一步的正交优化，选用混合正交表设计试验（陈魁，2000）。第一个因素选取4个水平，后3个因素各选取两个水平，正交试验设计见表2。
2.2.1 正交试验结果
对正交试验结果进行了极差分析，结果见表3。
依据表3由极差R值可知，各因素影响木聚糖酶活力的主次顺序为B>C>D>A。其中，菌种培养方式是主要影响因素。由K值可以选出4因素的最佳组合为A1B1C2D2，不在8次试验内，而表观最佳组合为A4B1C2D2。
2.2.2 验证试验结果
为了验证正交试验结果的可靠性，将极差分析得到的最佳工艺组合A1B1C2D2与表观最佳组合A4B1C2D2一起做验证试验，同时与基础培养基发酵产酶结果作比较。见表4。
验证试验结果表明，最佳工艺组合的酶活值、表观最佳组合的酶活值比基础培养基的酶活值分别提高了56.34%、63.73%；且最佳工艺组合优于表观最佳组合。
3 讨论
黑曲霉是被美国FDA认可的工业用安全菌种，所以利用黑曲霉固态发酵生产饲用木聚糖酶更具安全性。选用黑曲霉在优化条件下固态发酵生产饲用木聚糖酶具有生产成本低、经济效益高和生产工艺简单等特点，又能减少环境污染，变废为宝，因此具有一定的社会效益。
通过单因素试验和正交试验，优化的固态发酵生产饲用木聚糖酶的环境条件是：培养基初始pH值为5.5，料水比为1：1.5，麸曲种子的接种量为10%，置35 ℃下培养84 h,在此优化条件下酶活力达8 291.75 U/g鲜曲，比初始环境条件下所得酶活提高了63.73%。
（编辑：高 雁，）
王清，湖北工业大学生物工程学院，430068，湖北工业大学904信箱。
曾莹（通讯作者）、王永泽、邵进，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-09-30
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