张喜宏 刘义波 高云航
纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源，据估计，纤维素生成量每年高达1 000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限，目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。其中纤维素作为数量极其庞大的可再生资源，对其开展深入研究和利用是新世纪能源技术开发的关键，对于解决工农业原料、能源危机、环境保护等问题具有十分重要的意义。
纤维素的降解主要有三条途径，即酸解法、酶解法和微生物降解法。酸解法因生产成本高且对环境造成巨大污染而较少应用，酶解法和微生物降解法均以高效降解纤维素的菌株为基础。因此开展对纤维素酶及其高效分解菌株的筛选及功能学研究，不仅是开发利用纤维素资源的前提和关键，而且为纤维素酶基因的克隆及纤维素酶基因工程菌的构建奠定基础。
1 纤维素酶的研究概况
1.1 纤维素酶的来源
纤维素酶分布非常广泛。不但分布于细菌、真菌、植物和原生动物，而且无脊椎动物包括昆虫、疥虫、环节动物、贝类和线虫类等均可产生纤维素酶。在反刍动物的瘤胃中含有共生的纤维分解菌和原生动物；在高等植物中也含有纤维素酶；在微生物方面，真菌、放线菌及细菌等在一定条件下也可产生纤维素酶。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，其中研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中以1956年发现的木霉属真菌最为突出。
1.2 纤维素酶的种类
纤维素酶是指能够降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是由三类起协同作用且具有不同催化反应功能的酶组成的多酶体系，根据其催化功能的不同将其分为：Cx酶，又称葡聚糖内切酶、内切型纤维素酶（endo-1.4-β-D,glucanase，EC 3.2.1.4，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Len），这类酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。Cx酶分子量介于23~146 ku之间；C1酶，又称葡聚糖外切酶、外切型纤维素酶、纤维二糖水解酶(exo-1.4-β-D-glucanase,EC 3.2.1.91,来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex),这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解1，4-β-D糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶（cellobiohydro-lase），C1酶分子量介于38~118 ku之间；β-葡萄糖苷酶（β-1.4-glucosidase，EC 3.2.1.21，简称BG），这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子，β-葡萄糖苷酶分子量约为76 ku。这三类酶均具有专一性，但能相互协调，在这三类酶的协同作用下,将纤维素最终降解成为葡萄糖。
2 纤维素酶的研究进展
纤维素酶的研究始于20世纪40~50年代，Selliere等（1906）在蜗牛的消化液中发现能够分解天然纤维素的纤维素酶。Grassman等（1933）研究一种真菌的纤维素酶系并成功分离出2个组分。纤维素酶基因克隆研究始于20世纪70年代，发展非常迅速。目前人们已从40多种细菌和数种真菌中克隆了纤维素酶基因，同时构建了基因文库，其中一些酶的基因已在大肠杆菌和酵母中得到了表达，并进行了核苷酸序列测定。Guo R等（2008）在淡水蜗牛中克隆到了2种新的纤维素酶基因eg27I和eg27II，两种基因的核苷酸为588 bp，编码195个氨基酸，同源性达到94.5%，eg27I和eg27II均属于糖苷水解酶家族45。Wood等（2005）在大肠杆菌中表达欧氏菌的葡聚糖内切酶基因，最终得到的重组纤维素酶在每升培养基中可产生高达3 200 IU的内切酶酶活。熊鹏钧（2004）从深海沉积物样品ES0109中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3，对其16SrDNA序列分析表明该菌与假交替单胞菌属Pseudoalteromonas citrea和Pseudoalteromonas elyakovii的同源性均为99%。从DY3总DNA中扩增出一个约1.5 kb的片段,将该片段克隆到T载体上进行测序。分析表明，该片段长为1 479 bp，是一个属于糖基水解酶家族5的纤维素酶基因，命名为celX，利用pET-GST载体，celX基因在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中获得融合表达。王利英等（2007）转录L-山梨糖诱导绿色木霉（Trichoderma viride）AS3.3711纤维素酶基因，提取总RNA反转录获得cDNA，PCR扩增葡聚糖内切酶Ⅰ和葡聚糖内切酶Ⅲ的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株表达的EGⅠ酶活在诱导70 h时达到最高，为0.08 U/ml，表达的EGⅢ酶活在诱导60 h时达到最高，为0.03 U/ml。除此之外，定点突变、原生质体融合及基因重排技术被应用到高比活力纤维素酶的筛选中。黄艳（2008）以提取康氏木霉的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增纤维素酶cDNA，重组到T7启动子控制下的表达载体Pet.His中,构建重组质粒,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导3 h后,破胞提取菌体总蛋白,SDS-PAGE表明重组产物为45 ku与预期目的蛋白相一致的外源蛋白。徐天鹏（2007）以里氏木霉菌株为基因供体，采用外显子拼接法，以里氏木霉DNA为模板克隆了β-葡萄糖苷酶（BGLⅠ）基因，构建其酵母表达载体，并通过电击转化到毕赤酵母中，诱导其表达纤维素酶。丁少军等（2006）为了进一步提高从我国草菇中克隆的一种新的中性内切型纤维素酶（EG1）在Pichia pastoris中的表达水平，在前期研究基础上，利用高抗Zeocin转化子及高密度发酵的手段，使EG1的表达水平提高了34倍，蛋白表达量达8.80 mg/ml，EG1酶活达到543.36 IU/ml,实现了中性内切纤维素酶的高水平表达,大大促进建立我国纺织用纤维素酶大规模高效生产技术。Viikari等(2008)克隆了3种来自真菌的热稳定的纤维素酶(纤维素二糖水解酶、内切葡萄糖酶和β-葡萄糖苷酶)并将其插入Trichoderma reesei中稳定表达，组成了新的热稳定的纤维素酶混合物。此混合物的纤维素的降解率可以达到理论值的90%。Kang等（2007）分析了极端嗜热古菌Pyrococcushorikoshii中的一种超高温热稳定内切葡聚糖酶，通过定点突变方法鉴定了7个对酶活性关键的位点，还获得了一个长度截短的但催化活性与野生酶相同的工程酶。目前液体深层发酵技术已成为国外纤维素酶的重要研究和开发工艺，但在我国尚处于初步试验和开发阶段。在生物床基础上研究固定化细胞生产纤维素酶，又将成为纤维素酶生产工艺上的新突破。
3 纤维素酶产生菌选育的研究进展
选育优良菌种是提高纤维素酶活力的关键,纤维素酶高产菌株的筛选方法主要有诱变筛选和基因工程筛选方法。通常自然界分离筛选的野生型菌株其产酶能力相对较低。邱晔平等(2008)在腐烂的水葫芦中利用刚果红平板染色法分离筛选出一株产纤维素酶活性较高同时能高效降解水葫芦的优良菌株D1。在降解水葫芦中CMC酶活最高为2.262 μmol/(min·ml),滤纸酶活最高为1.592 μmol/(min·ml),该菌株经初步鉴定为绿色木霉。刘占英等(2009)从绵羊瘤胃内容物中分离出一株高效纤维素降解细菌,经形态学、生理生化反应和基因型的鉴定,鉴定为肠球菌属的一个种,将所测得的序列用Clustal W软件按Neighbor-Joining方法构建了16SrDNA系统发育树,并对该菌降解纤维素的特性进行了初步研究。Vladimir等(2008)比较了Lentinusedode和Pleurotus在不同植物材料底物及固态、液态发酵方式下产酶量变化，结果产酶差异很大，纤维素材料的性质和菌株培养的方法是影响酶表达和酶组成比例的决定因素。You-Jung Lee等(2008)筛选出一株可降解稻壳的菌株,通过16SrDNA分析和gyrA序列分析确定为Bacillus amyloliquefaciens并命名为B. amyloliquefacien sDL-3。通过SDS-PAGE分析,分子量大约54 ku。纯化酶可降解Avicel、羧甲基纤维素、纤维二糖，β-葡聚糖和木聚糖。最适温度50 ℃，最适pH值7.0。纤维素酶开放读码框架编码一个含499个氨基酸的蛋白。
为进一步提高纤维素酶活力，诱变育种是一种有效的方法。诱变育种又分为单一诱变和复合诱变。包衎等（2007）从堆肥、污泥、马粪和土壤中分离得到7株纤维分解菌。并以其中纤维素分解能力较高的一株菌为出发菌株,经紫外线诱变,刚果红纤维素平板透明圈选育法获得一突变株,对突变株纤维素分解菌进行酶活测定。结果表明,突变株具有最高的CMC酶活4.288 U/ml和FPA酶活4.957 U/ml。兰时乐等（2007）以纤维素酶产生菌TP1202为出发菌株，通过微波诱变和硫酸二乙酯、氯化锂诱变剂进行诱变，选育到1株纤维素酶高产菌株AS5。在适宜条件下，其产生的羧甲基纤维素酶（CMC）活力、滤纸酶（FPA）活力和棉花糖酶活力分别是出发菌株的107%、152.4%和140.5%。Adsul等（2007）研究发现，Penicillium janthinellum NCIM1171通过硫酸二乙酯处理24 h,然后紫外线处理3 min能得到产酶提高和透明圈明显的菌株,可在含0.2% 2-脱氧-D-葡萄糖的培养基上迅速生长。然后转到含1.5%的2-脱氧-D-葡萄糖的培养基有5个突变体。周新萍等(2007)从朽木中分离到1株产纤维酶活力高的放线菌NC-7菌株,经形态观察和生理生化测定,初步鉴定为放线菌链霉菌属,生二素链霉菌(Streptomyce,ambofaciens)。采用硫酸二乙酯和紫外线复合诱变方法对NC-7孢子进行诱变,得到产纤维素酶活力高的X402菌株和P3032菌株,其FPA酶活力分别为2.85、2.52 IU/ml，比出发菌株分别高38.95%、22.44%；CMC酶活力分别为4.83、5.29 IU/ml,比出发菌株提高13.21%、23.92%。由于纤维素降解菌诱变筛选具有一定的局限性，所以人们通过定向进化和分子改造基因工程方法筛选重组型高比活力的产纤维素酶菌株。目前利用基因工程技术将纤维素酶基因克隆到细菌、酵母、真菌和植物中取得了一定进展。刘永生等（2003）从具有降解天然纤维素稻草粉、甘蔗渣粉活性的地衣芽孢杆菌GXN151中分离、克隆出8个能够表达羧甲基纤维素酶活的基因，其中一个克隆为pGXNL2上的cei5A基因1 626 kb，可编码含542个氨基酸的羧甲基纤维素酶。这些克隆均在含CMC的LA平板上表达CMCaes活性，说明克隆基因可在大肠杆菌中表达且表达产物可被大肠杆菌分泌系统分泌到胞外。唐婧（2008）从花腐败残余物中分离到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株，通过菌体个体形态特征，菌落特征和生理生化试验结果，并结合16SrDNA序列分析对该菌进行了分类鉴定，该菌归属于克雷伯氏杆菌属，并将其命名为Klebsiella sp.SWU-27。提取该菌株的全基因组DNA，以大肠杆菌为表达宿主菌，通过鸟枪法，构建全基因组文库，从该菌株的基因组中克隆到一个含有1 230 bp，编码409个氨基酸的新的β-葡萄糖苷酶基因nglu02，HCA位点同源性分析及系统发育树分析表明，该基因属于纤维素酶Ⅰ家族。李旺（2007）从陕西杨凌取暖用地热水样中筛选出一种耐热性好、可分解纤维素的菌株，并通过基因工程技术改造其纤维素酶的调控基因，研究表明该菌产生的纤维素酶属于耐热性纤维素酶，具有较强的耐高温特性。Yoon等(2004)从桑粒天牛幼虫肠道中成功获得产纤维素酶菌株，并对其进行酶活性研究和纤维素酶基因克隆与表达。Ni J等（2007）将来自白蚁的4个内切葡聚糖酶基因进行了家族DNA改组（family shuffling）以获得热稳定性高的突变酶，所得PA68突变体酶的热稳定性提高了10 ℃，其CMC比活力达到其中一个亲本酶rRsEG的13.1倍。
4 总结
目前在纤维素酶及纤维素酶高产菌选育方面的研究已取得了较好的成效，但纤维素酶的生产仍然存在着酶活力低、生产周期长等问题，还不能真正应用于大规模工业化生产。纤维素酶高产菌的筛选及产酶研究仍是生物学研究领域的热点问题。相信随着微生物学、生物化学和分子生物学及其交叉学科的迅速发展，一定会获得适合工业化生产的高比活力纤维素酶。
（参考文献36篇，刊略，需者可函索）
（编辑：高 雁，）
张喜宏，吉林农业大学动物科技学院，130118，吉林省长春市新城大街2888号。
刘义波，辽宁千喜鹤食品有限公司。
高云航(通讯作者)，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-09-21 |
相关信息
