|
廖雪义 蓝 荣 葛俊宏
在畜禽饲料中，国内通常把玉米作为主要的能量饲料，很少使用小麦、大麦等麦类原料。主要是麦类饲料中含有非淀粉多糖（non-starch polysaccharide, NSP）等抗营养因子而限制了其在饲料中的应用。但随着我国养殖规模的不断扩大和饲料工业的迅速发展，将出现玉米供应紧缺的状况。据预测，到2020年我国能量饲料缺口将达到0.83亿吨[1]。由于NSP酶可以消除NSP的抗营养作用，不仅改善了麦类日粮在畜禽饲料中的利用价值，还因该酶可以减少氨、氮、磷等污染源的排放，改进了环境卫生和动物肠道微生物区系，增进动物健康[2-4]，再加上对饲料资源开发的迫切性和重要性，所以近年来NSP酶在麦类饲料中的研究逐渐受到重视。
现有NSP酶源微生物普遍存在酶活性低下、耐热性、抗酸性差等缺陷，酶生产效率低，并且对β-葡聚糖酶的研究多集中在芽孢杆菌，对真菌的研究较少。对白腐真菌的研究主要集中在木质素降解上，很少有NSP酶的研究。据此，选育酶活性高、稳定性好的NSP酶源菌株依然是重要的基础工作和重要的研究方向。本研究对菌株As56的产酶条件进行了初步优化，通过测定发酵前后戊聚糖含量和浸提液粘度的变化进行了NSP的微生物降解效果评价，并对菌株As56所产NSP复合酶的作用效果进行了体外评价。
1 材料与方法
1.1 菌种
As56购自中国科学微生物所，经实验室保存菌种。
1.2 培养基
1.2.1 斜面培养基
KH2PO4 3.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，维生素B1 微量（5μg/ml），葡萄糖 20g，琼脂 15.0g，马铃薯提取液 1 000ml，pH6.0。
1.2.2 基础液体产酶培养基
在Mandel’s营养液中加入2%的麸皮，0.2%的蛋白胨，pH约5.5。
1.2.2.1 Mandel’s无机营养液常量元素液 KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 1.4g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3g，加600ml蒸馏水使之溶解。
1.2.2.2 Mandel’s无机营养液微量元素液 FeSO4·7H2O 5.0mg/l， MnSO4·H2O 1.6mg/l，ZnSO4·7H2O 1.4mg/l，CoCl2 2.0mg/l，加200ml蒸馏水使之溶解。
将常量元素液与微量元素液混合后，用HCl调pH至5.5，再以蒸馏水定容至1 000ml即为Mandel’s无机盐营养液。
1.3 培养方法
1.3.1 碳源、氮源及其浓度优化方法
将As56培养物分别接入含有不同碳源、氮源及其不同浓度的基础液体产酶培养基中，28℃，120r/min振荡培养5d，测其非淀粉多糖酶活力。
1.3.2 培养温度优化方法
将As56培养物分别在20℃、25℃、28℃、30℃和37℃温度下，在液体发酵产酶培养基中培养5d，测各温度条件下的酶活力。
1.3.3 培养时间的确定
在基础液体产酶培养基中于28℃培养As56 11d， 并每12h测定酶活力一次。
1.4 体外粘度的测定
发酵前后麦麸体外提取液粘度的测定参照文献[5-7]。
1.5 戊聚糖含量的测定[8-13]
发酵前后麦麸中戊聚糖含量采用化学分析法测定，作3个平行3个重复，结果取平均值。
1.6 体外消化试验
1.6.1 人工胃液、人工肠液
参照文献[14，15]的方法配置。
1.6.2 体外消化试验步骤[16]
试验分2个处理，每个处理两个重复，依次为小麦对照组，小麦+NSP酶Ⅰ组。
体外消化步骤：称20g已粉碎的小麦粉，放入500ml的三角瓶中，加60ml人工胃蛋白酶液，再加5%NSP酶Ⅰ，用0.075mol/l HCl将pH调至2.5，在温度为39℃、振荡速度为50r/min的恒温水浴摇床上消化4h，然后加入60ml的人工肠液，用0.1mol/l NaOH将pH调至7.0。在上述条件下再消化4h。体外消化结束后，用200目滤布抽滤消化物，取滤液150ml，在40℃下预热5min，用DNJ-8S型数显粘度计（选用1号转子60r/min）测定其粘度，读取绝对粘度的数值。滤布上的残余物60℃烘干，待测各种养分消化率。
1.7 分析测定
1.7.1 液体发酵粗酶液提取[17]
液体培养菌液经3 000r/min离心10～15min，取上清液即为粗酶液。
1.7.2 酶活力测定
采用3，5-二硝基水杨酸法[18-23]测定酶活力。
2 结果与分析
2.1 最佳培养基碳源
在基础液体产酶培养基中，分别考察不同碳源对菌株AS56产酶的影响。菌株AS56在以a-乳糖为唯一碳源时，对β-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶的合成最好，其次为麸皮、蔗渣木聚糖。在以蔗渣木聚糖为唯一碳源时木聚糖酶合成最好，其次为麸皮、微晶纤维素，这表明a-乳糖、麸皮、木聚糖和微晶纤维素对酶的分泌具有较好的促进作用，这可能与半纤维素中含有这类化合物有关。对于3种酶的合成，蔗糖为最差（见图1）。
2.2 最佳培养基氮源
改变基础培养基中氮源种类，分别考察不同氮源对菌株As56产酶的影响。菌株As56在以牛肉膏为唯一氮源对酶合成最好，对于合成β-葡聚糖酶，柠檬酸氢二铵也是较好的氮源，对于木聚糖来说，蛋白胨仅次于牛肉膏，除柠檬酸氢二铵外，无机氮源培养基显著低于有机氮源（图2）。
2.3 碳源浓度的选择
以最佳碳源、氮源替代基础培养基中的碳源、氮源，但保持基础液体产酶培养基中氮源浓度不变，进行碳源浓度的选择。菌株As56合成酶的能力随着碳源浓度的增加显著提高，碳源浓度为4%时合成酶量最高。因此，碳源的最佳浓度选择4%（见图3）。
2.4 氮源浓度的选择
以最佳碳源、氮源替代基础液体产酶培养基中的碳源、氮源，但保持基础液体产酶培养基中的碳源浓度不变，进行氮源浓度的选择。菌株As56产β-葡聚糖酶，以牛肉膏浓度为0.1%时，酶合成量最高，但对于木聚糖酶则以0.2%为最佳。结果表明，同一氮源不同浓度对菌株As56产β-葡聚糖酶和木聚糖酶的作用效果是不同的（见图4）。
2.5 最佳产酶培养温度
菌株As56分别在20℃、25℃、28℃、30℃和37℃5个温度条件下在基础液体产酶培养基中培养5d，液体发酵结果表明，菌株As56所产β-葡聚糖酶和木聚糖酶均以25℃为最高（见图5）。
2.6 最佳产酶培养时间
在基础培养基中培养，每12h取样测定一次。菌株As56测至168h。由图6可见，在发酵前12h菌株As56不产β-葡聚糖酶和木聚糖酶。发酵24h时有微量的酶产生。24h后酶活性显著升高，β-葡聚糖酶在72～84h达到产酶高峰，以72h时产酶最高，此后逐渐下降，木聚糖酶在84h达到产酶高峰，该结果显示在发酵过程中，菌株As56产木聚糖酶和β-葡聚糖酶存在一定的时间差异，产木聚糖酶高峰时间滞后于产β-葡聚糖酶。
2.7 优化培养后的非淀粉多糖酶活力
综合上述各优化条件，建立优化液体产酶培养基和优化培养条件。菌株As56优化发酵液体培养基为：ａ-乳糖4%，牛肉膏0.1%， Mandel’s无机盐营养液，调pH5.5，优化培养条件为：25℃恒温培养72～84h。由表1可知，经优化液体发酵产酶培养基和优化培养条件后，菌株As56的β-葡聚糖酶活力达到736IU/ml，羧甲基纤维素酶活力高达830IU/ml，木聚糖酶活力为318IU/ml，均比未优化前的酶活力高，说明优化条件有利于菌株As56产生非淀粉多糖酶。
2.8 发酵前后饲料原料粘度、戊聚糖含量的变化
由表2可见，在菌株As56以麦麸为原料进行固体发酵时，发酵浸提液的粘度明显下降，戊聚糖含量降低了3.28%（P＞0.05）。可溶性阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖是形成粘性的主要原因。粘度的变化与NSP的含量显著相关。试验结果表明，发酵后，麦麸中阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖降解成较小的聚合物，从而使饲料的粘稠度降低。戊聚糖的降低量与对照相比，降低并不显著，说明经固体发酵后，多糖被NSP酶降解是以裂解为寡糖为主，只有少量的木糖、阿拉伯糖等游离糖生成。
2.9 体外消化
2.9.1 NSP酶对小麦体外养分消化率的影响
由表3可知，添加NSP复合酶使小麦干物质、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维的体外消化率比对照组分别提高了8.08%（P＜0.01）、6.72%（P＞0.05）、10.66%（P＜0.05）、17.01%（P＜0.05），说明NSP酶有利于小麦中非淀粉多糖的降解。
2.9.2 NSP酶对小麦体外消化滤液粘度的影响
从表4可见，添加NSP酶，粘度降低了2.49%（P＞0.05），但差异不显著。小麦中的NSP主要是阿拉伯木聚糖，β-葡聚糖含量较低，而NSP复合酶Ⅰ的组成以β-葡聚糖酶活性最高，木聚糖活性相对偏低，因此粘度降低不明显。
3 结论
3.1 通过优化产酶条件确定了菌株As56的最适培养条件和培养方法，在此条件下培养，测定其β-葡聚糖酶活力为736IU/ml，羧甲基纤维素酶活力为830IU/ml，木聚糖酶活力为318IU/ml。
3.2 添加菌株As56的NSP复合酶后，发酵前后饲料原料浸提液的粘度下降了56.59%（P＜0.01），饲料原料中戊聚糖含量下降了3.28%（P＞0.05）。
3.3 添加菌株As56的NSP复合酶使小麦干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维的体外消化率分别提高了8.08%（P＜0.01）、6.72%（P＞0.05）、10.66%（P＜0.05）、17.01%（P＜0.05），粘度降低了2.49%（P＞0.05）。
参考文献
1 王修启，张兆敏，李春群.加酶小麦日粮对猪生产性能的影响[J].中国畜牧兽医,2002,（2）:12～14
2 韩正康，Marquardt R R.畜禽营养中酶制剂.饲料酶制剂国际学术研讨会论文集，南京：南京农业大学出版社,1996
3 Frieden O D,Guenter W,Marquardt R R,et al..The effect of enzyme supplement on the apparent metabolizable energy and nutrient digestibility of wheat ,barley,oats and rye for the young broiler chick[J].Poultry Sci.,1992,(38):1 710～1 720
4 Marromichalis. I,Hancock J.D,Sene.B.W. Enzyme supplement and particle size of wheat in diets for nursery and finishing pigs[J].Animal Sci.,2001,（5）:3 086～3 095
5 王杰.体外黏度法评定小麦非淀粉多糖的含量.内蒙古农业大学论文,2002
6 刘强，汪儆，雷祖玉.小麦粘滞及小麦黏度的研究[J].动物营养学报,1999,11(4):44～50
7 Rotter B A.et al.. In vitro viscosity measurements of barley extracts as predictors of growth response in chicks fed ley-based diets supplemented with afungal enzyme preparation. Can, J Ani.,Sci., 1989,（69）:431～439
8 李春喜，邱崇波，姜丽娜.河南若干小麦品种子粒戊聚糖含量的初步研究[J].西北植物学报,2002,22(5):1 185～1 190
9 陈惠萍，谭支良.混合糠中戊聚糖的化学分析测定方法[J].饲料研究,1996,（7）:22～23
10 李春喜，邱崇波，姜丽娜等.不同生态条件下小麦粒中戊聚糖含量的研究[J].华北农学报,2002,17(2):1～4
11 周素梅，王璋，许时婴.面粉中戊聚糖含量测定方法的探讨[J].食品工业科技,2000,（6）:70～72
12 李昌文，欧阳韶晖，孙小凡. 小麦面粉中戊聚糖的化学分析测定法[J].西部粮油科技,2003,（4）:64～65
13 郝晓宏，韩琼.水溶性多糖3种测定方法的探讨[J].山西职工医学院学报,2003,（1）:2～4
14 于连富，姜艳春，金宁.应用改进消化法检测冷冻猪肉中旋毛虫[J].黑龙江畜牧兽医,1998,（9）:3～5
15 人工胃液、人工肠液.中华人民共和国药典,1990
16 许梓荣，李卫芬，孙建义.NSP酶对大麦体外消化的影响[J].中国粮油学报,2002,（5）:51～54
17 王淑军，杨从发，陈静.用于降解桔杆的纤维素酶产生菌的筛选研究[J].粮食与饲料工业,2001,（12）:21～23
18 刘永举，王清吉，王江青等.NSP法测定饲用β-葡聚糖酶活力[J].中国饲料,1999,（18）:6
19 刘德海，杨玉华，张发旺等.饲用纤维素酶活力测定方法的探讨[J].饲料工业,2002,（4）:34～35
20 聂国兴，李春喜，明红等.不同浸提方案对饲用木聚糖酶活性测定结果的影响[J].饲料工业,2003,（9）:35～37
21 BRECCIAJD Castro G R. et al.. Screening of xylanolytic bacteria using a color plate method[J]. Biotechnol., 1992,（23）:257～270
22 陆文清，李德发.影响饲料酶活力测定的因素分析[J].饲料研究,2002,（5）:15～18
23 堵苑苑.饲用非淀粉多糖活性分析的研究进展[J].动物营养学报,1998,（4）:11～17
廖雪义，襄樊学院化学与生物科学系，讲师，441053， 湖北襄樊市隆中路7号。
蓝荣，单位及通讯地址同第一作者。
葛俊宏，天津市津南区畜牧水产局。
收稿日期：2005-04-18
|
相关信息
