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吴小刚 曾 莹 周丽明 李 彦 何 平
摘 要 将经过筛选的产β-葡萄糖苷酶的米曲霉，通过单因子及正交实验对其产酶发酵条件进行了研究，结果显示：当培养基为:玉米芯 3%；豆饼粉 0.2%； KH2PO4 0.4%； CaCl2 0.04%； MgSO4 0.04%；自然pH；装液量为60ml时为最佳发酵条件。酶活力测定中采用了京尼平甙法测相对酶活。
关键词 β-葡萄糖苷酶；培养基；酶活力；发酵条件
中图分类号 S816.6
Study on Fermentation Condition of Aspergillus.orgzae Producing β-glucosidase
Wu Xiaogang, Zeng Ying, Zhou Liming, Li Yan, He Ping
Abstract An Aspergillus.orgzae producing β-glucosidase was selected. its medium ingredients and fermentation conditions were optimized by single facter and orthogonal experiments. The results are as follows: corncob 3%; beancake powder 0.2%; KH2PO4 0.4%; CaCl2 0.04%; MgSO4 0.04%; natural pH; liquid-installed 60ml. In the determination of the enzyme activity, we apply salicin treatment.
Key words β-glucosidase；culture medium；enzyme activity；fermentation condition
近年来，异黄酮的研究成为国际上一大研究热点。据不少研究表明，与异黄酮比较，异黄酮甙元具有广泛的生理活性，如具有抗肿瘤作用，尤其对与激素有关的肿瘤如乳腺癌和前列腺癌的抑制作用更为显著。此外，异黄酮甙元在治疗和预防心脑血管疾病方面也有明显作用。而微生物制备异黄酮甙元用于降血压的研究，国内尚属空白[1]。
本文是在对本研究小组筛选的一株产β-葡萄糖苷酶的米曲霉菌种进行发酵条件的研究基础之上得来的，对其培养基的碳氮比、pH值、溶氧、产酶发酵时间进行了摸索。把玉米芯、豆饼粉、麸皮等价格低廉的农产品的下脚料应用于工业发酵上来，能够制备出价值很高的异黄酮甙元降压药，同时也能解决农产品的下脚料的出路问题。如能尽快开发此类产品，不仅能填补国内市场的空白，还能够提高农产品的附加值，于国于民都有利。
1 材料与仪器
1.1 菌种
米曲霉O3：从豆豉中筛选而来。
1.2 主要仪器与试剂
栀子蓝甙水：武汉绿孚生物制品有限公司；α-纤维素：美国Sigma公司，分析纯；其它的药品均为分析纯；分光光度计：上海精密科学仪器有限公司，型号：722S。
1.3 培养基
1.3.1 斜面培养基
马铃薯培养基（PDA）[5]。
1.3.2 种子培养基
麸皮2%；α-纤维素1%；（NH4）2SO4 0.2%；KH2PO4 0.4%；CaCl2 0.04%；MgSO4·7H2O 0.04%。
2 方法
2．1 菌种的产酶条件研究[2]
2．1．1 产酶条件的单因子实验
分别测定在不同碳源、氮源、装液量、pH、培养时间等培养条件下，菌株的产酶量，优化菌种的产酶条件。
2.1.1.1 碳源 玉米粉、玉米芯、麸皮、麸皮+玉米粉、麸皮+玉米芯+玉米粉、麸皮+α-纤维素。
2.1.1.2 氮源 蛋白胨、豆饼粉、尿素、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4。
2.1.1.3 装液量 20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml。
2.1.1.4 pH 自然pH、4.0、7.0。
2.1.1.5 培养时间 24h、36h、48h、60h、72h、84h。
2．1．2 通过正交实验对接种量、C源、N源、含磷量进行研究，研究结果见表1。
2．2 酶活测定
京尼平甙法测酶活[3]：取7％京尼平甙溶液0.2ml，5％的谷氨酸钠溶液0.2ml，再加入0.1ml的酶液（发酵液），0.5ml pH为4.6的醋酸缓冲液，50℃保温24h，于722S分光光度计下测其吸光度。以吸光度大小比较β-葡萄糖苷酶的相对活力。
3 结果与分析
3．1 单因子影响产酶条件的研究
3．1．1 碳源对产酶的影响（见图1）
实验中所有碳源总量均为3%。由图1可以看出，玉米芯为最佳碳源，而玉米粉则不适合作为该菌种的碳源。
3．1．2 氮源对产酶的影响（见图2）
以上氮源用量均为0.2%。由图2可见，在实验范围，以蛋白胨作氮源时，产酶最高。对产酶有促进作用的氮源依次是蛋白胨、豆饼粉、NH4Cl、（NH4）2SO4、尿素、NH4NO3，其中，NH4Cl和(NH4)2SO4对产酶的影响是相当的。总的来看，有机氮源比无机氮源较利于该菌种产酶。NO3－中的氮元素对该菌株产酶的促进作用最小。
3．1．3 装液量对产酶的影响
通过改变装液量，来考察试验菌对溶氧的需求。实验结果见图3。
图3中，均是在300ml的三角瓶中进行发酵。由图可知，当装液量为60ml时，酶活最高。当装液量增加或减少时，产酶均会有不同程度的降低。
3．1．4 pH对产酶的影响（见图4）
培养基的pH影响细胞表面带电基团的解离及其微观结构，进而影响营养物的吸收及代谢物的分泌，导致微生物的生长和代谢发生变化。本实验用HCl溶液和NaOH溶液把发酵培养基的起始pH调为4.0和7.0以及自然pH进行发酵培养。
由图4可见，自然pH下，即pH为5.5时，产酶量最高，过酸或过碱会抑制产酶。
3．1．5 产酶曲线
取不同发酵时间的发酵液测酶活，结果见图5。
由图5可见，当发酵到60h，产酶基本达到最高值，60h后，产酶增长很缓慢，综合各方面因素，选择60h为最佳产酶时间。■
3．2 正交实验
在以上单因子实验的基础上，确定了正交实验方案，实验结果见表2。
3.3 数据处理
3.3.1 水平组合，提出预测优处理
由正交分析，从而提出预测的优处理组合是：A3B2C1D3。
3.3.2 极差分析
极差R的大小是说明此因子的不同水平产生差异的大小的量度，极差大说明该因子的不同水平产生的差异较大，是重要的因子。按照极差R大小排列出各因子的主次次序及预测的优处理。
主 次
3.3.3 趋势图直观分析
根据各因子3个水平的平均数（如A1=0.831，A2=1.082，A3=1.144）,可画出此实验4个因子的趋势图，见图6。
通过正交实验的结果分析可见，氮源是主要影响因素，最佳组合是：A3B2C1D3。
4 结论与讨论
①结果显示当培养基为：玉米芯3%；豆饼粉0.2%；KH2PO4 0.4%； CaCl2 0.04%； MgSO4 0.04%；自然pH；装液量为60ml时为最佳发酵条件；②在做产酶条件（碳源）研究时，玉米粉不利于菌株产酶，而玉米芯则正好相反，这可能是因为O3产生的β-葡萄糖苷酶是诱导酶。另外，促进产酶的几种碳源中，麸皮和玉米芯都是农副产品，价格便宜，这就为该酶的工业化生产创造了条件；③京尼平甙法与传统的用水杨苷的方法相比，具有操作简便，显色稳定等优点，但不足之处就是只能测其相对酶活、耗时较长。目前这种方法尚未有文献报道。
参考文献
1 余春槐.浅析大豆异黄酮的市场现状.中国食品报，2004，（115）
2 李平，宛晓春等.微生物发酵生产β-葡萄糖苷酶.安徽农业大学学报，2000，27（2）：196~198
3 孙力军，熊晓辉等.用二步法生产天然食用栀子蓝色素.南京农业大学学报，1994，17(4):98～101
4 李平等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质[J]. 安徽农业大学学报，1998，25(3):304~309
5 沈萍，范秀容等.微生物学实验.北京：高等教育出版社，1996
6 ALT N.et al.Biochem and Biophys Research Commu.,1979,90(2):537
7 Satoru Kusama.et al.Agric. Biol. Chem.,1985,49(7):2 055
吴小刚，湖北工业大学生物工程学院，430068，湖北武汉。
曾莹、李彦、何平，单位及通讯地址同第一作者。
周丽明，华中农业大学食品科技学院。
收稿日期：2005-03-07
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