王宁娟 高秀华
对各种饲料营养价值的准确评价是科学配制动物日粮的前提,只有精确了解各种饲料所真正含有的营养价值及动物对各种营养物质的需要量和动物对饲料的消化情况,才能合理地配制出真正符合动物生长需要的最经济的饲料产品。目前评价饲料营养价值的方法主要有检测饲料中各种营养成分的含量、进行动物试验和体外评价三种。检测饲料中营养成分的含量只能初步评价这种饲料的营养价值，因为动物体是一个复杂的体系,饲料在动物体内的消化结果如何，这是检测结果所不能说明的。动物试验能够真实地反映动物的实际需要水平和对饲料的利用情况，但动物试验受动物性别、年龄、体重、所处的生理状态及各种外界条件的影响。某种影响因素的难以控制,将导致测定结果的准确性受到影响，而且动物试验费时、费力、费财。在此情况下,体外评价法越来越受到研究人员和企业界人士的广泛关注。因为体外评价法具有操作简便,测定环境易于标准化,稳定性高,重复性好,成本较低等优点。许多学者做了大量的研究,结果表明体外评价法和动物试验法有很强的相关性,体外评价法可以替代动物试验法对饲料的营养价值进行评价。但是目前体外法在单胃动物方面的应用还没有统一的标准。本文综述了单胃动物体外评价法目前的应用概况、体外评价方法分类及其优缺点,并对体外评价方法研究过程中存在的问题及其发展趋势进行了综述。
1 体外评价法的应用
1.1 对单一饲料原料的营养价值和配合饲料营养价值进行评价
通过测定蛋白质、氨基酸、矿物质、微量元素、淀粉、干物质、能量等的体外消化率对动物饲料原料及配合饲料效果进行评价。Graham(1989)利用体外评价法测定了5种日粮干物质、能量、灰分、粗蛋白、淀粉和纤维素等的消化率，并与猪的回肠消化率和真消化率进行相关性分析对照，结果表明二者有较好的相关性。Boisen等(1991)用胃蛋白酶-胰酶两步法测定几种不同的饲料，其蛋白质消化率与用大鼠和猪实验所测得的粪真消化率紧密相关，用同一方法测定8种常用饲料的氨基酸回肠消化率发现，氨基酸的体外消化率通常与氮的体外消化率紧密相关。
1.2 对饲料添加剂的使用效果进行评价
评价酶制剂生物学价值,唐茂妍(2002)用胃蛋白酶-胰酶两步法评定加酶饲料蛋白质消化率,结果表明体外评价法与动物试验法达到强相关,证明体外法可以替代动物试验对动物的蛋白质的消化率进行预测。方热军等研究体外透析法评定饲料磷的透析率及其可透析磷预测模型,采用体外透析法测定了19种植物性饲料和2种混合饲料磷的透析率,考察了饲料总磷、植酸磷和植酸酶与透析率之间的关系,建立了体外法预测饲料可消化磷的数学模型。
1.3 筛选和研制新型复合酶制剂
由于体外评价法不受动物、饲养环境和试验条件的限制，可以大批量地同时进行，因此可以同时做很多个不同的处理和组合，通过研究饲料中常用酶制剂的不同添加水平筛选出单一酶制剂的最佳添加水平，进一步通过几种常用饲料酶制剂的不同组合，快速地筛选和研制新型复合酶制剂。也可用体外法研究不同类型饲料添加剂的相互作用及最佳配合比例。
1.4 建立新的饲料原料数据库
可以利用体外评价法对众多的饲料原料针对不同的用途采用不同的指标进行评价，进而可以为新的饲料原料数据库进行修改和更新提供更加真实的数据参考。
1.5 评估饲料中所含抗营养因子的负效应
如评价植酸和小麦中抗营养因子的负效应，进而采用添加植酸酶来消除饲料中植酸所带来的负作用，添加木聚糖酶消除小麦日粮中小麦抗营养因子的负作用。
2 单胃动物体外评价方法分类及其优缺点
总结各种文献资料，把体外评价法按照所模拟的部位及所使用的酶类分为三类。
2.1 一段法
主要模拟胃部的消化过程，即胃酶水解法。该法主要是用来评定饲料中蛋白质的营养价值。所用胃酶主要有胃蛋白酶（Sheffner等，1956；Hewitt等，1985）、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶（Buchanan等,1969;Maga等,1973）和链霉蛋白酶(Hewitt等，1985)。但目前应用最多的还是胃蛋白酶，因为动物体内胃部的主要消化酶是胃蛋白酶，胃部其它酶含量较低。但这个方法测定结果易受pH值和胃蛋白酶剂量的影响。pH值越低，胃蛋白酶活性越好，所测得蛋白质消化率高。保持pH值不变，胃蛋白酶剂量越大，所测得蛋白体外消化率越高，但这样评价的饲料蛋白体外消化率基本没有差别，因为当胃蛋白酶剂量足够高时，低质的蛋白质饲料也将被全部降解。而且胃部酶解法只模拟了胃部的消化过程，对后肠段的消化没有考虑，蛋白质饲料除了受胃蛋白酶降解外，还受到小肠中胰蛋白酶、糜蛋白酶的降解和大肠中一些微生物的降解。因此，胃部酶解法只能作为初步的蛋白质饲料评价方法。
2.2 两段法
两段法即胃蛋白酶-小肠液法、胃蛋白酶-胰蛋白酶法、胃蛋白酶-胰液素法。这个方法充分考虑了单胃动物的消化特点，不但模拟了胃部的消化过程，也模拟了小肠的消化过程。因此所测得的结果更接近实际值。这个方法使所评价饲料种类范围进一步扩大，不但可以评价蛋白质饲料，还可评价矿物质饲料原料及配合饲料。两段法根据其所使用的消化酶不同分为胃蛋白酶-小肠液法、胃蛋白酶-胰蛋白酶法、胃蛋白酶-胰液素法。
胃蛋白酶-小肠液法主要是在胃蛋白酶水解的基础上，模拟小肠的pH值、温度及消化酶浓度，小肠液是直接从动物体内获取的消化液，这更接近动物的消化实际，但所用消化液所含消化成分变动幅度较大，稳定性差，用此方法测出的结果可比性差。胃蛋白酶-胰蛋白酶法可以准确地评价蛋白质饲料的体外消化率，并与体内消化率有极强的相关性，但对矿物质及配合饲料的评价准确率较差。因为小肠的消化酶除了胰蛋白酶外，还含有淀粉酶、脂肪酶、糜蛋白酶等。因此只有充分考虑各种酶的综合效应才能得到准确的体外评价效果；胃蛋白酶-胰酶法，这是目前应用最多的两步法，胰酶中包含了小肠中主要的消化酶类，并且胰酶已经商品化，稳定性较好，但胰酶没有考虑不同动物之间酶谱的差异性，因此还不够精确。
目前应用最多的两步法是由Boisen等(1995)的两步法。其操作程序如下:准确称取1 g(精确到0.001 g)过60目筛饲料,加入到100 ml锥形瓶中,每个样品同时做一个空白。再加入25 ml磷酸盐缓冲液(0.1M、pH值6.0),并不断搅拌，模拟胃的蠕动功能。再加入10 ml 0.2M的HCl，调节pH值2。再加入1 ml新鲜猪胃蛋白酶溶液。再加入0.5 ml氯霉素乙醇溶液防止微生物的生长。将烧瓶封口后放入39 ℃的水浴中消化6 h后取出。加入10 ml磷酸盐缓冲液(0.2 M，pH值6.8)和5 ml 0.6 M NaOH溶液，用HCl或NaOH将pH值调至6.8。然后加入l ml猪胰酶(sigma P-1790 )溶液，封口，放入39 ℃的水浴中继续消化18 h，并不断搅拌，模拟饲料在小肠内的消化过程。小肠消化期结束后加入5 ml 20%的硝基水杨酸，静置30 min，使溶解于水而未被消化的蛋白质沉淀出来。过滤末消化的残渣，烘干称重，可测定干物质、蛋白质、有机物质和能量等养分的含量。计算消化率，并利用空白样校正。
用此方法测得的干物质、蛋白质、有机物质和能量等养分的消化率与体内法显著相关，但此方法的缺点是没有充分考虑不同动物其消化器官、pH值、消化酶的组成的区别，另外操作程序比较麻烦，消化时间长，也没考虑到消化产物对酶促反应的抑制作用，忽略了大肠段微生物对饲料养分的消化作用。因此在两阶段法的基础上产生了三段法。
2.3 三段法
三段法即胃蛋白酶-胰酶-瘤胃液法和胃蛋白酶-胰酶-碳水化合物酶法。由于大肠的微生物组成与瘤胃液接近。三段法最初选择用瘤胃液模拟大肠微生物进行大肠段的消化。但瘤胃液获取比较麻烦，而且所含成分随采食日粮不同变异度大。不同试验所测结果可比性、重复性差。大肠的消化主要是各种微生物参与的消化过程。微生物对各种物质的消化主要依靠微生物酶的分解作用。因此只要像小肠中胰酶一样，配合各种微生物酶，用它来代替瘤胃液将更容易操作些，所测得结果也比较稳定。Boisen等（1997）对两段法进行了改进，确立了一套模拟整个消化道体外操作程序。其主要操作步骤为：两阶段法消化结束后,向混合物中加入10 ml的0.2 M的EDTA溶液。调节pH值至4.8，加入0.5 ml碳水化合物酶（Viscozyme 120 L，120FBG/g,Novo-nordisk)，封口,在39 ℃的水浴中继续消化18 h,将剩余残渣过滤、烘干,测定各种营养成分的含量,计算消化率。用此方法测定的30种配合饲料的体外有机物质消化率与体内消化能之间存在线性相关,(R2=0.94)。充分证明了该方法的可行性与可靠性。
三段法优于二段法和一段法，在于它不但模拟了胃中的消化过程而且模拟了后肠对饲料的消化。相对于前两种方法来说，三段法更复杂些、更精确些、测定成分更多些，它不但可以用来预测蛋白质的消化率，而且可以预测淀粉、脂肪、钙、磷、粗灰分、粗纤维等消化率，使可评价的指标范围变宽，应用更加广泛。而且测定环境易于标准化，稳定性高，实验室之间可比性强。不但可以测定某一时间点的降解率而且还可以测定饲料动态降解率。
3 单胃动物体外评价法研究过程中存在的问题及其发展方向
单胃动物体外评价法经过多年的研究和发展，已取得很多可喜的成果，并随着动物生理研究的深入及各种相关学科的发展，将逐步走向成熟。但体外评价法依然有些问题需要进一步的研究和解决。
3.1 单胃动物体外评价法研究过程中存在的问题
动物体内的消化过程是复杂的、高度精密和完整的体系，是通过神经和激素调控对各种刺激发生反应的动态过程。目前的各种方法只是对动物消化道中的部分数据进行模拟，而对小肠吸收功能及对消化道中的微生物在消化过程中的作用的模拟还有待于进一步研究。
目前还缺乏动物胃肠道消化参数的准确数值，因为日粮的种类和营养物质的含量，动物的日龄、性别和生理状况都对消化参数有很大的影响。因此需要进行大量的试验积累更多的体外数据，找出其中规律性，达到对动物消化体系的准确模拟。制定一套标准的体外评价体系，对所使用的动物种类、年龄、动物试验的环境、试验动物所使用的饲料的标准进行统一的规定，这样才能使所测的结果有可比性。所做的试验在不同的试验室中有很好的重复性。
体外评价体系操作过程受到人为影响因素比较大。不同操作人员可能得到不同的试验结果。目前的解决办法就是尽量做到精确的前提下，进行更多的重复。因此很有必要用精密的仪器设备代替人工操作，实现整个过程自动化。最大程度地消除人为因素所造成的误差，扩大检测规模，这样体外法的应用前景将更加广泛。
3.2 单胃动物体外评价法研究发展方向
3.2.1 试剂标准化和精确化
使试验所用的各种酶商品化，能够在市场上购得稳定的单一酶制剂的商品，所使用的标准试剂也能够在市场上方便地买到。试验仪器的标准化，试验过程中所有用到的试剂都要量化，准确化。
3.2.2 设备精密化和自动化
除了样品准备人工操作外，其它所有的程序都完全自动化，这样即可以消除人为因素的误差，也可以批量进行检测扩大检测范围，缩短检测周期。
3.2.3 操作机械化和简单化
争取实现整个操作环节的机械化，从加料到各种酶的添加、酸碱度的调节及样品的转移等，都要实现机械化操作。
3.2.4 模拟仿生化和规模化
研究动物消化过程的变化规律，按仿生学原理，用具有半透膜性质的透析管模拟动物肠道消化吸收的生理环境，以活力稳定的生化试剂(酶)代替猪小肠液，研究单胃动物体外评价法的最适宜反应条件，为最终建立一个适用于评价单胃动物饲料营养价值的体外动态评价体系提供依据。
目前，单胃动物体外消化条件的模拟技术还未成熟，整个体外消化评价体系的硬件设计也没有形成。随着对动物消化生理的不断深入研究，再结合机械学、动物营养学、仿生学、计算机学等几门学科知识，只有这样体外评价法在单胃动物饲料评价方面才有更加广阔的前景。
参考文献
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王宁娟，中国农业科学院饲料研究所，博士，100081，北京市海淀区中关村南大街12号。
高秀华，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-06-27 |
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