马俊孝 刘玉庆 马向东 张景燕
目前，常规饲用原料供应日趋紧张，为节省成本非常规原料被越来越多地应用于动物日粮配方中。另外，畜禽的饲料利用率不高，饲料中相当一部分的营养物质随粪便排出体外。由于酶制剂能够消除饲料中的一些抗营养因子，补充幼龄畜禽的消化酶，提高饲料消化率，从而提高动物的生产性能，降低生产成本，酶制剂在饲料中的应用得到了普遍认可。随着饲用酶制剂在饲料中的广泛使用，市场上出现了不同的酶制剂产品，选择合适的酶制剂产品是困扰使用者的难题。通过体外实验对酶制剂进行分析，可以在一定程度上对酶的品质做出评定，并预测其在动物体内的作用效果。本文从酶活测定、消化道内环境对外源酶活性的影响及体外酶解等方面综述了饲用酶制剂的体外评定技术，以期为用户科学合理地选择酶制剂产品提供参考。
1 体外评定的必要性
酶制剂的作用效果长期以来都是用饲养实验来证明，饲养实验与实际养殖条件非常接近，能够真实地反映出外源酶对畜禽生产性能的影响。但饲养实验往往耗费大量的财力、物力和人力，很难在短时间内对饲用酶产品的效果进行评价分析，而且饲用酶制剂在不同的饲养实验中作用效果报道有时不一致。因此，饲养实验法评价酶制剂的效率不高，其应用推广受到一定的限制。鉴于此，有必要建立一种快速、简易的实验室方法，对饲用酶产品的作用进行评价，预测酶制剂在动物日粮中的应用效果。
用体外消化法模拟动物肠道消化吸收的生理作用，在体外通过测定加酶前后营养物质消化率的变化，可对酶制剂的作用效果进行评估。酶制剂的体外评价，能简单、快速地证明酶制剂的作用效果，提高选择酶制剂产品的效率。
2 体外评定方法
2.1 酶活测定
目前，考察酶的活力是酶的生产厂家控制产品质量时的一个重要指标，酶的用户在选择酶制剂时通常都会关注酶活的高低，在进行酶学性质的研究时也需要进行酶活测定。随着酶制剂工业的发展，酶活检测水平已得到了相应的提高，在一般化验室即可开展。对于酶活检测中的一些影响因素以及这些因素不同值下的对比关系已有大量而深入的研究和报道。目前，测定酶活的方法主要有比色法、粘度法、免疫学法及凝胶扩散法等。
需要注意的是，很多生产厂家均制定了切合自己利益的酶活测定方法，有些方法甚至脱离了畜禽实际情况。应用不同方法测得的酶活结果有显著差异，酶用户应该注重有效酶活力，即在接近动物消化道温度和pH值条件下测定的酶活力，谨慎看待厂家标示的酶活力或按厂家提供方法测定的酶活力。另外，仅仅通过酶活力的高低来比较不同酶制剂产品的质量是很困难的。这是因为不同的酶是由不同的微生物发酵产生的，并且不同微生物产生的酶其最佳pH值、温度和对底物的亲和性都不相同，很难用同一种方法测得的酶活大小来评判酶的优劣。
2.2 肠道环境耐受性
如何使酶制剂顺利通过胃部的酸性环境并在小肠段仍保持较高的酶活力，一直是酶的生产者和使用者十分关心的问题。酶制剂的本质是蛋白质，动物消化道中的各种蛋白酶势必会影响酶制剂的稳定性，而且食糜在胃和肠道的停留时间较长，因此，饲用酶要求有较好的耐酸和耐内源蛋白酶的稳定性。通过体外实验可以考察酶在消化道环境中的稳定性，从而对酶的优劣做出评判。
已有的研究表明，外源酶的活性受畜禽消化道低pH值、胃蛋白酶和胰酶等因素的影响很大。史凯来等(2000)报道,在真胃pH值条件下，2种植酸酶所表现出的活性仅为最适pH值条件下的77.82％和49.61％，而在鸡嗉囊pH值条件下，2种植酸酶活性均与最适pH值条件下接近。马俊孝等（2009）通过模拟鸡的胃肠道环境，研究了酸及内源蛋白酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）对不同来源的饲用木聚糖酶活性的影响，结果表明，经过酸及蛋白酶处理后，不同的酶样品酶活性变化较大，损失最少的为60.8%，最大的达93.1%。由此可见，外源酶的活性受畜禽消化道低pH值、胃蛋白酶和胰酶等因素的影响很大。
杨会涛（2006）等研究表明，在pH值4.0、温度40 ℃保温60 min后木聚糖酶酶活损失在50％以上。李卫芬等（1999）用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理木聚糖酶，发现随着处理时间延长，木聚糖酶活力逐渐下降，处理4 h后，其残余酶活力分别为24.49%和72.86%。而张红莲等（2002）对橄榄绿链霉菌AI产木聚糖酶的研究发现，用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理木聚糖酶30 min后，木聚糖酶依然保留95%以上的活性。这表明木聚糖酶受消化道条件的影响程度与酶的菌种、生产工艺等多种因素有关。
此外，许多研究者也从其它角度对酶的品质进行了分析，如对饲用酶在加工过程的稳定性，耐受温度、pＨ值、金属离子以及储存稳定性等因素的影响的分析。
2.3 体外酶解
酶活大小毕竟不能反映外源酶在体内真实的作用情况，体外法评定酶制剂是通过对动物消化道内温度、pH值、消化酶分泌、胃肠运动和养分吸收等参数的模拟，在体外条件下建立与畜禽消化道内环境接近的一种实验室操作方法，可以用来对各种酶制剂进行酶解效果的评价。饲用酶的体外消化方法参照了对饲料利用率的体外分析的流程，通过体外测定加酶和不加酶饲料中营养物质消化率的变化来评价、比较酶制剂的作用效果。
2.3.1 实验方法
直接酶解法是用来评定饲料酶的简单易行的方法，其主要原理是利用外源酶水解饲料底物，通过测定产物中某种化学物质的变化判断酶的品质并预测酶在动物体内的酶解效果。直接酶解法仅探讨了酶在设定的温度条件下的酶解情况，忽略了动物体内胃和消化道对底物、酶的影响，因此这种方法的可靠性较低。
胃蛋白酶-胰蛋白酶（或胰酶）两步法是被广泛接受的用来评价外源酶的方法，与体内情况更为接近。该方法先在含有胃蛋白酶的酸性条件下用外源酶降解饲料样品，再用含有胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶等多种消化酶的胰酶（胰脏提取物）在接近中性条件下继续酶解饲料底物。这种方法充分模拟了动物的胃肠道环境，能比较客观的对酶的应用效果做出判断。
在两步酶解法的基础上，一些研究者的报道中采用了两步酶解-透析法，结合透析技术可将消化产物及时排出，模拟了小肠的吸收作用，从而消除产物对酶解反应的抑制，更准确地模拟了饲料在体内的消化过程。
2.3.2 体外酶解参数的确定
饲料在畜禽消化道内的消化过程，是由胃肠道物理运动和多种消化酶参与下的复杂的生理系统，了解动物消化道内环境的情况是体外模拟消化技术的关键环节。对于体外酶解反应而言，选择适宜的消化道酶制剂、酶浓度、反应温度、pH值、时间以及反应装置等实验参数至关重要。
张铁鹰等(2007)确立的体外消化模拟方法，酶活水平、pH值和食糜含水量以及胆汁酸水平等消化参数均以肉仔鸡空肠部分的消化参数作为参考,而消化时间与食糜在整段小肠的停留时间大体相当。陈化鹏等(1997)分析了3个因素（发酵器类型、胃蛋白酶溶液的浓度、瘤胃液的来源）对5类饲料植物干物质体外消化率测定结果的影响，结果表明，发酵器类型(恒温水浴箱和恒温保温箱)和胃蛋白酶溶液的浓度(2.3%和4.6%)对5类饲料植物干物质体外消化率的测定结果均无显著的影响。同样，不同来源的瘤胃液（家羊、马鹿、狍）对饲料植物干物质体外消化率的测定值也无显著的影响。
将酶解过程放在透析袋内进行，使用的透析袋的截留分子量对体外养分消化率也有影响。Gauthier等（1982）在用体外法评价蛋白酶解效果时选用截留分子量为1 000 D的透析袋，选择性的使氨基酸和短肽（8~10个氨基酸）通过，与体内消化的终产物分子量非常接近。张铁鹰等（2007）报道，透析袋截留分子量加大时，粗蛋白和淀粉体外消化率均显著提高（P<0.01）。
3 体外评定技术的应用
3.1 酶作用效果评价
饲料或原料在体外经过加酶消化，考察酶制剂的使用效果，从而为增加非常规原料在畜禽饲料中的用量，扩大原料来源提供依据。谭权等（2007）的体外研究表明，木聚糖酶对不同能量饲料的木聚糖的降解程度不同，对小麦、麦麸的总木聚糖的降解程度最大，其次为玉米，对米糠总木聚糖降解程度最小。徐子伟等（2004）的研究表明，对大麦的酶解中葡聚糖酶起主导作用，木聚糖酶的作用较小，而对黑麦和小麦则以木聚糖酶的作用为主。李卫芬等（2004）研究了添加NSP酶对早籼稻谷及其糙米体外消化的影响，添加非淀粉多糖复合酶制剂后干物质、粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的体外消化率均显著提高，达极显著水平。
3.2 优质酶制剂选择
体外模拟消化实验是选择优质酶制剂的一种简便、快捷的方法，和动物饲养效果有较强的相关性，通过体外实验可以对不同的酶制剂进行比较,从而选择优质酶制剂。王前光等(2006)利用体外酶解法快速评定4种不同酶制剂在小麦型日粮中的效果,结果表明,木聚糖酶和β-葡聚糖酶活力相对活性较高的E1效果不明显,木聚糖酶和β-葡聚糖酶含量相对活性较低的欧蒂酶的应用效果最好，并推测这可能与酶制剂的耐酸能力有关。Simbaya等(1996)在总结前人研究基础上，采用了体外酶解透析技术，对13种蛋白酶和8种碳水化合物酶通过测定加酶后蛋白质和碳水化合物体外酶解的量进行了体外评价和比较，结果与体内结果有很好的一致性。
3.3 筛选最佳酶谱组合
酶具有高度的选择性和专一性，不同的酶作用于不同的底物。饲用酶要作用的底物主要是粮食与农副产品，成分复杂，含多种抗营养因子,只有在多种酶的协同作用下才能降解这些物质，最大限度地提高饲料的营养价值。因此，饲料用酶的酶谱组合无疑至关重要。
王恩玲等(2008)利用体外消化实验和二次回归旋转正交组合设计，进行了体外法优化肉鸭日粮非淀粉多糖酶酶谱的研究，实验结果表明，日粮的NSP组成和含量不同，其最佳酶谱也存在较大差异，且NSP酶和日粮离体消化能之间存在显著的回归关系。谢新东等（2000）采用以胃蛋白酶稀盐酸溶液和猪小肠液两个阶段处理的体外消化实验方案，筛选了复合酶中纤维素酶、植酸酶、蛋白酶和淀粉酶的组合，通过测定鸡和猪的复合酶饲料的能量消化率筛选出最佳的复合酶组合，他们还通过饲养实验验证了离体法在复合酶配方筛选中的可行性与实用性。由此可见，针对不同日粮中NSP的组成和含量，可通过体外实验筛选与之相对应的NSP酶谱。
3.4 酶用量优化
通过体外酶解方法，考查酶对饲料原料的降解效果，可以建立外源酶的用量与不同能量饲料间的定量关系，为饲用酶的合理使用提供科学依据。张慎忠等（2007）通过体外酶解实验,建立木聚糖酶与不同蛋白质饲料种类的定量关系。张铁鹰等（2005）探讨了利用肉仔鸡体外消化模拟装置评定不同剂量植酸酶作用效果的可行性，结果发现，日粮添加不同剂量的植酸酶后，磷的体外消化率和无机磷的释放量与肉仔鸡各项生长指标均存在强的相关性。谭权等（2007）通过体外酶解实验建立了木聚糖酶添加水平与原料之间的定量关系，以总木聚糖含量变化为指标时，每千克玉米、小麦、麦麸和米糠的适宜木聚糖酶添加水平为1 380、1 987、2 887和1 000 IU，以水溶性木聚糖含量变化为指标时，每千克玉米、小麦、麦麸和米糠的适宜木聚糖酶添加水平为500、2 108、6 958和1 000 IU。
4 体外实验的前景
酶制剂的体外分析技术是酶制剂效果评判中应用最为广泛的一种方法，目前，酶的体外评定方法从操作的简便性和模拟结果的科学合理性方面均有很大发展，酶制剂作为一种功能复杂的生物活性成分，它不直接提供营养成分（如维生素），但又与营养成分的利用直接相关。近年来，饲料酶制剂的应用对传统的动物营养学说提出了新的课题，原来的原料数据不一定能反映出饲料原料在酶制剂作用后的有效营养值。酶制剂体外消化技术的目的是能更简便、快速、准确地估测酶在体内的作用效果，而上述新问题的深入研究将反过来促进体外实验技术的进一步发展，从而更科学地评定酶制剂的价值。
（参考文献30篇，刊略，需者可函索）
（编辑：高 雁，）
马俊孝，康地恩生物集团，261500，山东省高密市夷安大道东祥和路南（夏庄工业园）康地恩生物科技有限公司。
刘玉庆，山东省农业科学院畜牧兽医研究所。
马向东、张景燕，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-10-18 |
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