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李 融 苏 琰
海藻糖（Trehalose）又名茧蜜糖、蘑菇糖、漏芦糖或簟糖，是在动物、植物、微生物中广泛分布的一种低聚糖，当生物处于逆境时，其含量增加，是一种典型的应激代谢产物。海藻糖由两分子的吡喃葡萄糖单体以α－1，1－糖苷键连接而成，其化学名为α－D－吡喃葡萄糖基-α-D－吡喃葡萄糖苷，分子式为C12H12O11，相对分子量为378.33（含两分子结晶水），熔点为97 ℃，加热会失去结晶水。由于其分子结构对称，无半缩醛基，所以既无还原性，也无变旋光性。海藻糖除了具有低聚糖的一般特性（低热值、抗龋齿性、非消化性、有膳食纤维的作用、有利于双歧杆菌的增殖）外，还有其独特的物理化学特性，甜度为蔗糖的45％；耐热耐酸，是二糖中最稳定的。既使与氨基酸、蛋白质等混合加热也不会发生美拉德反应，一般的酶不能将其水解。海藻糖具有很好的防腐性，对逆境具有高抗性，许多含海藻糖的动植物完全干燥后仍维持其活性，一旦遇水后，立即复活。海藻糖的生物保护机制一般认为是其生物保护机构能强力地束缚水分子，与脂膜质共同拥有结合水或海藻糖本身起到代替膜结合水的作用，从而防止蛋白膜的变性。由于其具有抗逆、抗寒、抗旱、耐高温、吸水、低甜度、保湿、生物保护等特点，使得他在食品、保健品、医药、化妆品、农业等方面有很大的应用前景，已成为近年来研究的热点。
植酸酶是一种能水解植酸的酶类,具有很多生理功能,饲料中添加植酸酶,可以提高磷的利用率,保护环境,植酸酶在畜禽养殖上的应用已基本得到肯定。目前植酸酶虽然广泛应用,但在制粒过程中酶活的丧失或下降始终是制约它应用的一个问题,在制粒高温(75~95 ℃)过程中,植酸酶的活性将会大幅降低。目前已对生物提取的植酸酶进行了包被,加入了一些化学物质,提高了其高温条件下的稳定性,其中海藻糖已经被作为一种包被成分在商品植酸酶中使用,本试验选用海藻糖和商品植酸酶为材料来研究海藻糖对商品植酸酶的耐高温的影响。
1 材料与方法
1.1 主要设备仪器
恒温水浴锅：（37±0.1） ℃；分光光度计(有10 mm比色皿，可在415 nm下测定吸光度)；EMS－9A型磁力搅拌器；PHS－3C型酸度计（可精确至小数点后两位）；电炉子、电子秤、移液管、移液枪(1、5 ml)、试管（5、10、20 ml）、烧杯（5、10 ml） 、量筒、温度计（1~100 ℃）等。
1.2 主要试剂及配制方法
商品用植酸酶(黄褐色小颗粒,活性为5 000 U/g);植酸钠、海藻糖均购自北京拜尔迪生物技术有限公司。
乙酸缓冲液：称取30 g三水合乙酸钠和0.126 g无水氯化钙，溶解在约500 ml蒸馏水中，用冰醋酸调节pH值至5.5，定容至1 000 ml，保存期1周。
植酸钠溶液(7.5 mmol/l)：称取0.693 g肌醇六磷酸钠(Sigma公司生产)于100 ml容量瓶中,用乙酸缓冲液溶解并定容至刻度，现用现配。
硝酸溶液：量取100 ml浓度为65%的浓硝酸与200 ml蒸馏水混合。
钼酸铵试剂：称取100 g钼酸铵(天津市化学试剂四厂生产),溶解在800 ml蒸馏水，再加入10 ml 25%的氨水，定容至1 000 ml，储存于暗处。
钒酸铵试剂：称取0.235 g钒酸铵，溶解在70 ml水中，预热至55 ℃，加入2 ml稀硝酸，定容至100 ml储存于暗处。避光条件下保存1周有效。
颜色终止液：移取2份硝酸溶液、1份钼酸铵溶液，1份钒酸铵溶液混合后使用，现用现配。
基准物（磷酸二氢钾，购自天津市北方天医化学试剂厂），各种常用玻璃器皿（需不含磷）。
1.3 试验设计
1.3.1 酶样试剂的准备
精确称取1 g植酸酶(精确到0.001 g)、1 g植酸酶＋40 mg海藻糖、1 g植酸酶＋60 mg海藻糖、1 g植酸酶＋80 mg海藻糖，置于100 ml容量瓶中,加入约70 ml pH值为5.5的乙酸缓冲液，在磁力搅拌器上高速搅拌30 min，制成悬浮液。将此悬浮液静置0.5 h，直至上清液完全析出后取上清液待用。每个样品做1个平行样，逐级稀释测定酶活性。
1.3.2 酶样试剂的稀释（逐步稀释）
酶液用醋酸缓冲液进行适当稀释,控制吸光度 OD值在0.1～0.6,确保试验结果准确度。
取上清液1 ml于1号试管中,加入醋酸缓冲液4 ml,摇匀;取1号液1 ml于2号试管中,加入醋酸缓冲液3 ml,摇匀;取2号液1 ml于试管中,加入醋酸缓冲液2 ml,摇匀。(待反应液)具体稀释步骤如下（见表1）。
1.3.3 反应步骤
每组取4支试管(样品和样品空白各设1个平行,取其平均值)分别加入1.8 ml醋酸缓冲液,再各加0.2 ml待反应液。摇匀，37 ℃预热5 min。样品中加4 ml底物，样品空白中加4 ml终止液，摇匀。37 ℃水浴反应30 min（样品空白可以不反应）后，样品中加4 ml终止液，空白中加4 ml底物，摇匀，静置后在415 nm下测定吸光度OD415。具体反应步骤见表2。
1.4 酶活力测定
1.4.1 测定方法
采用绝对法（仲裁法）。
1.4.2 酶活力单位定义
酶活力单位定义：37 ℃，pH值为5.5条件下，每分钟水解植酸钠溶液释放1 μmol无机磷的酶量为1个酶活单位。活性赿高，单位时间内水解植酸、植酸盐的量就越多。
1.4.3 待测酶液的制备
精确称取两份1 g的植酸酶(精确到0.001 g)、1 g的植酸酶＋40 mg海藻糖、1 g的植酸酶＋60 mg海藻糖、1 g的植酸酶＋80 mg海藻糖，置于100 ml容量瓶中，加入约70 ml pH值为5.5的乙酸缓冲液，在磁力搅拌器上高速搅拌30 min，制成悬浮液。
1.4.4 绘制标准曲线
准确称取0.680 4 g在105 ℃烘至恒重的基准物磷酸二氢钾于100 ml容量瓶中,用乙酸缓冲液溶解,并定容至100 ml,浓度为50.0 mmol/l,再按表3中的比例稀释成不同浓度,按表2中的步骤与试样一起反应并测定,以无机磷浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,列出直线回归方程(y=ax+b)。标准曲线的数据见表3和图1。
1.4.5 酶活力计算
将反应完的溶液在室温下静置10 min达澄清后在分光光度计415 nm波长处测定样品空白的吸光值和样品溶液的吸光值。
其原理是利用植酸酶水解植酸盐释放无机磷，通过加入酸性钼-钒试剂，使水解反应停止，同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在波长415 nm下进行比色测定磷的含量。以标准磷溶液(或标准植酸酶)为参照，计算酶活力。
酶活力计算公式：U=F×C/30m
式中：U——试样中植酸酶的活性（U/g）；
C——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的磷浓度；
F——试样溶液反应前的总稀释倍数；
m——试样质量（g）；
30——反应时间（min）。
以相应不加热的酶活力作对照(100％)，测定植酸酶活力保留率。
酶活力保留率(％)=(加热后酶活/不加热的原酶活性)×100%=(85 ℃后反应得到的OD415/不加热原酶样反应后得到的OD415)×100%
以不加海藻糖的酶活力保留率为对比，比较海藻糖对植酸酶热稳定性的影响。根据公式计算酶活力。
2 数据计算与结果分析
2.1 数据计算（见表4）
C1=(0.170-0.035)/0.035=3.857，U1=6 000×3.857/30=771.4；
C2=(0.058-0.035)/0.035=0.657，U2=6 000×0.657/30=131.4；
C3=(0.103-0.035)/0.035=1.943，U3=6 000×1.943/30=388.6；
C4=(0.112-0.035)/0.035=2.2，U4=6 000×2.2/30=440;
C5=(0.126-0.035)/0.035=2.6，U5=6 000×2.6/30=520。
酶活保留率U'2=(U2/U1)×100%=(131.4/771.4)×100=17.1%；
酶活保留率U'3=(U3/U1)×100%=(388.6/771.4)×100=53.4%；
酶活保留率U'4=（U4/U1）×100%=（440/771.4）×100=57.1%；
酶活保留率U'5=（U5/U1）×100%=（520/771.4）×100=67.4%。
2.2 结果分析
添加不同量的海藻糖对植酸酶热稳定性的影响(见图2)
从图2可见，植酸酶溶液中加入等体积的海藻糖溶液,85 ℃处理5 min后均能提高在高温下的热稳定性，加入40、60和80 mg海藻糖的植酸酶其酶活保留率分别达到了53.4%、57.1%和67.4%，较原酶活保留率17.1%分别提高了36.3、40、50.3个百分点。添加80 mg海藻糖对植酸酶的热稳定性提高效果最好。
3 讨论
3.1 研究进展
酶的稳定性一直是困扰其大规模应用的主要原因。为了保持酶的活力，国内外大多采用在浓缩液中加入金属离子、多元醇、多糖类化合物等方法。海藻糖作为一种多醇化合物，既可通过氢健与酶蛋白表面分子相连结，也能通过氢健有效地与外部水分子相连结，使酶蛋白分子稳定。本试验在植酸酶中加入不同质量的海藻糖均能提高商品植酸酶在高温下的热稳定性，其中以80 mg海藻糖的效果最好。其在生产中的应用如何尚需作进一步的研究。
随着基因工程与蛋白质工程技术的发展，定点突变、同序方法和定向进化技术将逐渐应用于酶的热稳定性研究。在分子水平上对植酸酶基因进行改造，使植酸酶本身就具有良好的热稳定性无疑是很有意义的。
3.2 影响试验效果的其它因素
在试验过程中由于试验条件和试验环境的限制，试验结果受诸多因素的影响，其影响因素除了pH值、温度、湿度、作用时间、抑制剂、激活剂、底物和产物浓度，以及植酸、植酸酶来源等外，还表现在以下几个方面:① 植酸酶的活性会因放置时间的加长而使其活性降低，故其酶活力保留率也会随之降低。② 试验水浴温度不太稳定时有变化，从而使试验结果出现偏差。
4 结论
本试验采用绝对法对不同浓度的海藻糖对植酸酶热稳定性的影响进行研究，结果表明添加80 mg海藻糖对植酸酶的热稳定性提高效果最好，酶活力保留率提高了50.3个百分点。在植酸酶液中加入海藻糖比不加时酶活力保留率提高36.3~50.3个百分点。
（参考文献20篇，刊略，需者可函索）
（编辑：沈桂宇，）
李融，天津农学院动物科学系，300384，天津。
苏琰(通讯作者)，扬州大学生物科学与技术学院。
收稿日期：2009-05-04
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