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程时军 马立保 张 伟
摘 要 试验旨在探讨溶菌酶对肉鸡肠道粘膜形态、微生物数量及血氨浓度的影响，采用单因素试验设计，选择144只艾维茵肉鸡随机分为4组：对照组、抗生素组及2个剂量溶菌酶组（每千克日粮分别添加溶菌酶150、300 g），每组6个重复，每个重复6只。考察不同处理组肉鸡肠道形态、微生物数量及血氨浓度，试验结果表明：溶菌酶可改善42日龄肉鸡十二指肠及空肠粘膜形态，降低有害微生物（梭菌和大肠菌类）数量, 对双歧杆菌和乳酸菌无显著影响（P>0.05），可极显著降低血氨浓度（P<0.01）。
关键词 溶菌酶；肠粘膜形态；微生物数量；血氨；肉鸡
中图分类号 S816.3
1 材料与方法
1.1 试验动物
1日龄艾维茵肉鸡144只，购自武汉正大有限公司。
1.2 试验日粮
溶菌酶(500 000 U/g)由武汉新华扬生物股份有限公司提供，酶活单位定义：在25 ℃、pH值为6.2的条件下，于450 nm处每分钟引起溶酶小球菌体溶液吸光度下降0.001为1个酶活力单位(U)。
试验日粮参照《中华人民共和国农业行业标准NY/t 33—2004》配制玉米－豆粕型粉料，基础日粮配方及营养水平见表1。
1.3 试验分组
采用单因子试验设计，共分4组，每组6个重复，每个重复6只，公母各半，试验分组及日粮处理见表2。
1.4 饲养管理
试验于2008年11月20日至12月31日在湖北省饲料检测站动物试验房内进行，分0~21、22~42 d两阶段地面平养；室内温度按艾维茵肉鸡饲养标准控制；在2~3周龄时以地克珠利饮水防球虫病；免疫程序为：7 d新城疫Lasota+传染性支气管炎H120二联苗滴鼻、点眼；14 d IBD饮水；21 d IBD饮水。
1.5 样品收集及处理
于42日龄清晨从各处理组鸡中随机选取6只（每重复1只），翅静脉采血约5 ml后注入医用肝素钠抗凝管，置于冰盒上保存待测。
鸡屠宰后立即解剖，剪取十二指肠、空肠约1 cm,用生理盐水冲洗干净，立即投入4%福尔马林固定液固定。同时取十二指肠、空肠各2 cm左右，并以棉线结扎两端，用酒精棉球消毒各结扎口，置于冰盒送实验室超净台待测。
1.6 指标检测方法
1.6.1 血氨
翅静脉采血,送武汉陆军总医院采用SYNCHRON UniCel DxC 800全自动生化分析检测。
1.6.2 肠粘膜组织
取肠用生理盐水洗净，4%甲醛固定，以酒精梯度脱水，再用石蜡包埋切片，厚度5 μm，然后脱蜡水化后HE染色，中性树胶封片，最后用显微摄影分析系统测量小肠肠壁厚、隐窝深度、绒毛高度。
1.6.3 食糜微生物数量
在超净工作台中，分别取0.5 g食糜，加入4.5 ml稀释液(PBS)，静置5 min后,取上清液0.5 ml于4.5 ml稀释液中，依次倍比稀释到10-8后，分别从10-5、10-6、10-7、10-8浓度离心管中取100 μl于乳酸菌、大肠杆菌、双歧杆菌及梭菌培养基培养，培养条件见表3。以每平皿菌落数30～200个为有效，每样作2平行取平均数。菌落数计数公式：
每克内容物菌落数=log10[(菌落数×稀释倍数×每次稀释取样毫升数)/(接种用样品毫升数×样品克数)]
1.7 主要仪器
莱卡SM2400包埋机；日本樱花Tissue-Tek切片机；图像采集系统：尼康80i显微镜及NIS-Elements D2.30图像采集系统；Thermo Forma Direct Heart CO2 Incubator(5% CO2)；HDL Apparatus无菌操作台；DNP-9162型电热恒温培养箱等。
1.8 数据分析
数据用平均数±标准差表示，采用SPSS16.0软件进行ONE-WAY ANOVA分析，并以LSD作多重比较。
2 结果与分析
2.1 溶菌酶对42 d肉鸡肠粘膜形态的影响（见表4）
从表4可以看出，抗生素和溶菌酶极显著提高了十二指肠绒毛高度（P<0.01），溶菌酶组对十二指肠绒毛高度的提高幅度与抗生素组相比差异不显著（P>0.05）；溶菌酶2组和抗生素组显著提高了空肠的肠绒毛高度（P<0.05），各处理也有降低十二指肠隐窝深度的趋势，其中溶菌酶2组显著降低十二指肠和空肠的隐窝深度，分别达23.9%和19.8%（P<0.05）。
2.2 溶菌酶对42 d肉鸡十二指肠食糜微生物数量的影响（见表5）
从表5可以看出，与对照组相比，各处理对十二指肠梭菌总数有极显著降低趋势(P<0.01)，降幅分别达4.03%、2.6%和5.6%；抗生素和溶菌酶处理2组极显著降低了大肠杆菌总数（P<0.01）；各处理对十二指肠双歧杆菌和乳酸菌有降低的趋势，但无显著差异（P>0.05）。
2.3 溶菌酶对42 d肉鸡空肠食糜微生物数量的影响（见表6）
从表6可以看出，与对照组相比，抗生素组极显著降低了空肠梭菌总数（P<0.01），溶菌酶处理组也有显著降低（P<0.05），且溶菌酶处理组和抗生素对梭菌的效果无明显差异（P>0.05）；溶菌酶1组显著降低了空肠大肠杆菌总数（P<0.05）；各处理对空肠双歧杆菌和乳酸菌有降低的趋势，但无显著差异（P>0.05）。
2.4 溶菌酶对肉鸡血氨浓度的影响（见表7）
从表7可以看出，各处理组均可极显著降低肉鸡血氨浓度（P<0.01），降幅达17.3%以上，3个处理组间差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
3.1 溶菌酶对肉鸡肠粘膜形态的影响
小肠是动物吸收营养物质的主要场所，小肠微绒毛可使小肠吸收面积增加约20倍(沈霞芬，2001)，肠绒毛高度增加可使小肠接触营养物质的面积增加，增强对营养物质的吸收功能，所以肠绒毛形态与机体生长发育有关(Caspary，1992)。隐窝深度反映了隐窝细胞的增殖率和成熟度，即反映了细胞生成率，不断有细胞从隐窝深度基部向绒毛端部迁移、分化，形成具有吸收能力的绒毛细胞，以补充绒毛上皮细胞的脱落。隐窝细胞生长速度减慢会造成肠绒毛萎缩(詹东玲等,2002)，肠粘膜萎缩会使小肠吸收功能受损（Waston，1988；Miura,1992）。绒毛长度与肠上皮细胞数量显著正相关，隐窝变浅表明肠上皮细胞成熟率上升，分泌功能增强（即向绒毛端部迁移增加）（韩正康，1991）。
Humphrey等(2002)研究禽日粮抗生素替代品时，发现老鼠表达人的乳铁蛋白和溶菌酶饲喂肉鸡时也有抗生素的作用：给Cobb肉鸡饲喂每千克日粮添加176 mg溶菌酶的饲料，饲料效率相对对照组显著提高（P<0.05），十二指肠绒毛高度增加，回肠固有层变薄，肠上皮及粘膜粒性白细胞减少，表明在肉鸡日粮中溶菌酶可替代抗生素使用。本试验发现，抗生素和溶菌酶极显著提高了十二指肠绒毛高度(P<0.01),溶菌酶对十二指肠绒毛高度的提高幅度与抗生素无异(P>0.05)；溶菌酶2组和抗生素组显著提高了空肠的肠绒毛高度(P<0.05),各处理也有降低十二指肠隐窝深度的趋势，其中溶菌酶2组显著降低十二指肠和空肠的隐窝深度分别达23.9%和19.8%(P<0.05),表明溶菌酶可有效改善肉鸡肠道粘膜状况,与Humphrey等(2002)报道一致。
3.2 溶菌酶对肉鸡肠道微生物数量的影响
肠道菌群最终反映其与宿主及日粮的共生关系，微生物的变化会影响动物的健康、生长及成熟（Hill M J，1982），这点从早期在动物中使用抗生素便可看出（Moore P A等，1946；Stokstad E L R等，1949）。口服抗生素、日粮的差异（Knarreborg A，2002）及病原微生物的感染（Kimura N，1976）都会影响肉鸡肠道微生物菌落数量。
很多学者认为抗生素促生长机制取决于整个肠道总的微生物数量或种属的减少(Visek, 1978a;Jensen,1998；Close,2000；Gaskins等,2002；Collier等,2003)。如无菌动物口服抗生素，无促生长效果（Coates等,1955；Coates等,1963）。一些人认为其作用在于：微生物数量的下降可减少同营养物的竞争和那些抑制生长的微生物代谢物(Visek,1978a；Anderson等,1999)。
溶菌酶对动物肠道微生物数量的影响也有报道（DR Brundige 等，2008），本试验结果发现，在肉鸡日粮中使用溶菌酶，各处理组鸡十二指肠内容物梭菌总数有极显著降低趋势（P<0.01），对空肠梭菌总数有显著降低趋势（P<0.05），溶菌酶处理2组极显著降低了十二指肠大肠杆菌总数(P<0.01)，溶菌酶1组显著降低了空肠大肠杆菌总数（P<0.05）；各处理对十二指肠和空肠双歧杆菌和乳酸菌都有所降低,但无显著差异（P>0.05），原因可能是梭菌为阳性菌,对溶菌酶及抗生素较敏感，这些结论与杨露青等（2003）研究报道的结论较类似，她研究比较溶菌酶抑菌作用的检测方法时发现，溶菌酶对阳性菌（金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌及乙型溶血链球菌）作用效果较阴性菌和真菌好，阴性菌如大肠杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌对溶菌酶也比较敏感，枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌对其不敏感，本试验发现，溶菌酶对一般认为的有益菌如双歧杆菌和乳酸菌的影响不大。
3.3 溶菌酶对肉鸡血氨浓度的影响
动物体内的氨主要来自氨基酸脱氨基作用，消化道细菌脲酶也可利用部分含氮饲料产氨。对温血动物而言，低水平血氨对动物有利，它可以通过脱氨基的逆反应参与机体代谢；高浓度的氨无论是在体内还是在环境中被认为是一种毒性物质（Phillips等，1952；Visek，1964、1968、1972）。无菌动物不具有活性的脲酶，因而其血氨浓度仅为常规动物的25%(Warren等,1959)。动物体内微生物显著影响肝门脉血氨浓度（Dintzis等, 1953）。
一定条件下, 抗生素能抑制脲酶活性，并降低肠道中氨的浓度（Alvares 等，1964)，降低血氨（Warren等，1959）。佟建明（2001）发现，在肉鸡日粮中添加金霉素，可显著降低血液中氨、尿酸含量，增加氮沉积。Carlie(1984)和Visek(1978)对抗生素影响肠道、血液和环境中氨浓度的作用进行了深入研究,证明抗生素确实具有降低动物组织和环境中氨浓度的作用，从而促进动物快速生长。Krinke(1996)研究发现，日粮中添加阿伏霉素后，肠道微生物活动减少，氨浓度降低，动物生长加快。本试验结果发现，溶菌酶和抗生素均可极显著降低肉鸡血氨浓度（P<0.01），降幅达17.3%以上，溶菌酶和抗生素之间效果差异不显著（P>0.05），本试验中血氨浓度的降低可能是各处理降低肠道微生物数量所致。
4 小结
溶菌酶可改善肉鸡十二指肠及空肠粘膜绒毛高度及隐窝深度，有利于肉鸡肠道健康;可减少肉鸡十二指肠、空肠内容物大肠菌类和梭菌的数量，对双歧杆菌和乳酸菌无明显影响（P>0.05）;可极显著降低肉鸡血氨浓度（P<0.01），与抗生素降低血氨效果无差异（P>0.05）。
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（编辑：高 雁，）
程时军，武汉新华扬生物股份有限公司，430074，武汉市东湖开发区凌家山南路5号。
马立保（通讯作者），华中农业大学动物营养系。
张伟，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-08-18
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