戚炯炯 张 嘉 单丽君 叶兴乾 郑晓冬
摘 要 以实验室筛选的一株可同时产纤维素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶的宇佐美曲霉A.usamii-CF1为生产菌株，以柑橘皮为原料，对固体发酵培养基的水分含量、起始pH值、碳源、无机盐及柑橘皮粉与豆粕比例对产酶率的影响进行了研究，研究发现，当培养基配方为橘皮粉53%、豆粕23%、麸皮19%、尿素1%、Na2HPO4 2%、MnSO4 2%；最佳培养基水分为55%～60%时，菌种产酶活力达到CMC酶41.6U/g、β-葡萄糖苷酶102.2U/g、木聚糖酶2 079.6U/g、酸性蛋白酶7 884.6U/g。经干燥后的复合酶储存性能稳定。
关键词 A.usamii-CF1；柑橘皮；固体发酵；复合酶
中图分类号 Q814
我国是柑橘生产大国，每年都会产生大量的副产物——柑橘皮。柑橘皮富含果胶、纤维素、可溶性糖及多种矿物质元素，是一种良好的微生物生长基质。目前，对柑橘皮的研究主要集中在内含成分的提取，对利用微生物发酵柑橘皮生产酶制剂的报道较少。吴厚玖[1]等（1997）开展了柑橘皮渣发酵饲料中间试验研究，Ismail[2]（1996）对微生物液体发酵柑橘皮产酶进行研究。用柑橘皮为原料，固体发酵生产复合酶制剂的方法在国内外未见报道。我们的试验旨在研究酶系较全、产酶水平较高的宇佐美曲霉A.usamii-CF1利用柑橘皮进行固体发酵产酶的最佳条件。
1 材料与方法
1．1 材料
菌种:实验室选育菌株A.usamii-CF1。
斜面培养基（PDA培养基）：20%土豆汁、2%葡萄糖、1.8%琼脂,自然pH值。固体基础发酵培养基（简称基础培养基）：干燥橘皮粉4g、豆粕1g、尿素0.1g、水10ml，自然pH值。
试剂: DNS试剂、0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液（pH值4.8）、0.1M乳酸-乳酸钠缓冲液（pH值为3.0）、福林试剂(Folin试剂)、0.4M碳酸钠溶液、0.4M三氯乙酸溶液、2%酪蛋白溶液（pH值为3.0）、100μg/ml酪氨酸溶液。
1．2 方法
1．2．1 固体发酵方法
在250ml三角瓶中，装入固体发酵培养基，搅拌均匀，121℃灭菌20min，冷却后接入由斜面培养基培养后制成的浓度为107个/ml的孢子悬浮液1ml，置于28℃生化培养箱中发酵培养60h，测定各种酶的酶活。
1．2．2 酶的抽提
取一定量的发酵固体，加入10倍发酵固体量的蒸馏水，间歇搅拌1.5h，一层滤纸过滤得粗酶液，用蒸馏水稀释后作酶测定用。
1．2．3 酶活测定方法及定义
纤维素酶[羧甲基纤维素（CMC）酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶（FPA）]测定采用DNS法[4]。酶活定义为：在pH值为4.8，温度为50℃条件下，每分钟水解各底物产生1μmol葡萄糖所需的酶量为1个纤维素酶活力。
酸性蛋白酶活力测定采用福林酚法[5]。酶活定义为：在pH值为3.0，温度为40℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位（U）。
木聚糖酶的活性测定采用李彩霞（2001）介绍的方法[6]。酶活定义为：在pH值为4.8，温度为50℃的条件下，每分钟产生1μmol木糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活力单位（U）。
2 结果与分析
2．1 培养基水分含量对产酶的影响
用不同水分含量的培养基进行发酵试验，发酵结束后测定发酵基质中纤维素酶、木聚糖酶和酸性蛋白酶的酶活（结果见图1）。从图1可以看出：培养基含水量对各种酶组分产酶量具有显著性影响，CMC酶在水分含量60%时产酶活性最高；而FPA酶酶活和β-葡萄糖苷酶在水分含量在55%时产酶活性最高；木聚糖酶在水分含量60%～70%时产酶活性较稳定；酸性蛋白酶在水分含量50%～55%时产酶活性最高。本文综合考虑各种复合酶酶活，取培养基含水量为55%～60%为最佳。
2．2 培养基起始pH值对产酶的影响
用不同起始pH值的培养基进行产酶试验，试验结果如图2所示。由图2可知，当培养基起始pH值低于5时对菌株产酶有一定影响，而在高于5较广的pH值范围内（pH值5.0～9.0）对菌株产酶影响不大。经测定，基础固体发酵培养基所配制的培养基提取液的自然pH值是5.40，因此，本研究以自然pH值为最终的发酵产酶培养pH值。
2．3 不同有机碳源对产酶的影响
在基础培养基中分别添加1g不同种类的碳源进行产酶试验（见图3）。由图3结果显示，添加麸皮有利于纤维素酶酶活和酸性蛋白酶酶活的提高，但所有的辅助碳源的添加都不利于木聚糖酶酶活的提高。经综合考虑，确定添加少量的麸皮作为培养基的辅助碳源。
2．4 不同的无机氮源对产酶的影响
在基础培养基中分别添加0.05g不同氮源进行发酵试验（见图4）。由图4结果显示，氮源的添加对复合酶的生产具有显著影响。添加各种氮源都能明显提高β-葡萄糖苷酶的产酶率，其中 （NH4）2SO4、 NH4NO3、CO(NH)2和Mg（NO3）2能提高一倍以上。NH4NO3 和CO(NH)2 能较大幅度的提高FPA产量（分别比对照提高了29%和50%）。各种氮源对CMC酶活的提高效果都不大，所添加的氮源除了（NH4）2SO4外对木聚糖酶都有一定的抑制作用。不同氮源对酸性蛋白酶的影响较大，其中CO(NH)2对酸性蛋白酶的产生具有较大的促进作用（产酶率提高31.2%）。
2．5 柑橘皮粉与豆粕比例对产酶的影响
将柑橘皮粉与豆粕配制成不同的比例进行发酵试验（见图5）。
结果发现，当不添加豆粕的时候，几乎不产酸性蛋白酶。当柑橘皮粉与豆粕的比例为8：2时，CMC酶、滤纸酶和木聚糖酶分别已经达到了酶活最高值；当柑橘皮粉与豆粕的比例为7：3时，酸性蛋白酶达到了酶活最高值；当柑橘皮粉与豆粕的比例为6：4时，β-葡萄糖苷酶达到最高值。综合考虑，认为柑橘皮粉与豆粕比例为7：3较合适。
2．6 不同的无机盐对产酶的影响
在基础培养基上添加0.1g的各种无机盐。结果见表1。
从表1可以看出，CaCl2对纤维素酶有提高作用，但对木聚糖酶有抑制作用；KH2PO4、K2HPO4能提高酸性蛋白酶酶活，但是对羧甲基纤维素酶和木聚糖酶有一定的抑制作用；Na2HPO4和NaH2PO4能使木聚糖酶酶活提高，且具有显著性差异，但是Na2HPO4对酸性蛋白酶有一定的抑制作用。MnSO4的添加能提高各类酶活，但不具有显著性差异，综合考虑各类无机盐对复合酶的影响，确定在培养基中添加MnSO4和Na2HPO4各0.1g。
2．7 酶学性质及稳定性研究
用柑橘皮粉53%、豆粕23%、麸皮19%、尿素1%、Na2HPO4 2%、MnSO4 2%以及水分含量为55%～60%的培养基进行浅盘扩大发酵试验，经干燥将所得发酵产物制成酶制剂粗制品。该粗制品为灰褐色粉末，易溶于水。各酶组分的活力分别为：CMC酶41.6U/g、β-葡萄糖苷酶102.2U/g、木聚糖酶2 079.6U/g、酸性蛋白酶7 884.6U/g。此复合酶最适宜pH值为3.0～6.0，最适反应温度为40～50℃。在常温下储存4个月后测定酶活（见图6）发现该酶制剂的粗制品储存性能稳定。
该复合酶酶系较全，在酸性（pH值3.0～6.0）条件下稳定，且酸性蛋白酶和木聚糖酶的酶活较高。适用于多种饲料。
参考文献
1 吴厚玖，焦必林， 王华，等.柑桔皮渣发酵饲料中间试验研究.中国饲料，1997，17(3)：37～39
2 Abdel-Mohsen Saber Ismail. Utilization of Orange Peels for Production of Multienzyme Complexes by Some Fungal Strains. Prosess Biochemistry, 1996,31(7):645～660
3 单丽君.利用柑橘皮固体发酵生产复合酶菌株的选育.菌物学报2005,24(2)：227～234
4 杨斌，吕燕萍，高孔荣，等.分解蔗渣的研究Ⅰ菌株的选育及其固态发酵条件的研究.华中农业大学学报，1997, 16(4):311～319
5 中华人民共和国专业标准ZB X 66030-87
6 李彩霞，房桂干，刘书钗.木聚糖酶酶活的具体测定方法.林产化工通讯,2001,35(1):20～23
（编辑：孙崎峰，）
戚炯炯，浙江大学生物系统工程与食品科学学院食品科学与营养系，310029，杭州。
张嘉、单丽君、叶兴乾、郑晓冬（通讯作者），单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2006-06-08
★ 基金项目：浙江省重大招标项目 |
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