付石军 孙建义
植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称，其对单胃动物的饲喂效果已得到广泛的证实[1]。添加植酸酶能够显著提高植物性饲料中磷的利用率，减少饲料中无机磷的添加量以及动物粪便中无机磷的排出，降低植酸磷的抗营养作用，促进动物生长发育，减轻环境的磷污染，提高畜牧生产和生态效益。
以往植酸酶的研究主要集中在酸性植酸酶上，酸性植酸酶只适用于胃中pH值呈酸性的单胃动物以及少数鱼类如虹鳟等，但不适用于消化道为中性的淡水鲤科鱼类和畜禽消化道中呈中性的部位。目前，对中性植酸酶的分子生物学、编码基因的分离克隆及表达等方面还缺乏较深入的研究。
1 中性植酸酶的来源
中性植酸酶主要来源于芽孢杆菌，芽孢杆菌植酸酶不仅具有较好的热稳定性，有助于抵抗饲料制粒过程中高温引起的酶失活，而且其酶促反应的pH值有效作用范围在7.0~7.5之间，可以有效弥补酸性植酸酶的不足。目前已分离出多种产中性植酸酶的芽孢杆菌（Bacillus），主要是枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、淀粉液化芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）及其它菌株（Bacillus sp）等。
2 中性植酸酶基因结构
来源于枯草芽孢杆菌的植酸酶基因phyC全长1 290bp，包括编码383个氨基酸的开放阅读框、-35序列（TTGACA）、-10序列（TAACAC）、核糖体结合序列（AAGGAGGAA）和一个转录终止子。-35序列是枯草芽孢杆菌表达的共有序列,为RNA聚合酶提供识别位点，-10序列主要是有利于局部双链解开，终止密码子紧跟在一段由二重对称序列组成茎环结构的后面[2]。
来源于地衣芽孢杆菌的植酸酶基因phyL全长1 146bp，编码381个氨基酸,上游有-10序列（GATGTTA）、核糖体结合序列（AGGAGG）和两个-35序列（TTGACA）[4]。
芽孢杆菌中性植酸酶的基因序列与以往报道的来源于丝状真菌酸性植酸酶基因均无同源性，也不含有丝状真菌和真菌来源的植酸酶蛋白中均存在的高度保守序列RHGxRxP[5]，故芽孢杆菌植酸酶不属于组氨酸酸性植酸酶家族。
3 中性植酸酶的催化机制
Kerovuo等[6]利用高效液相色谱法（HLPC）研究了枯草芽孢杆菌植酸酶对植酸的降解，认为植酸通过第二位和第四位磷酸结合在酶的浅裂缝旁边,在中间的磷酸（第3位）将面对着活性部位，随后被切割，释放出肌醇-1,2,4,5,6-五磷酸中间产物，接着肌醇五磷酸再结合到裂缝上，这次是第二位和第六位磷酸结合上去，第一位磷酸将面对着活性部位而被切割，形成肌醇-2，4，5，6-四磷酸，同样道理第五位磷酸被切去，形成肌醇-2，4，6-三磷酸。肌醇-2，4，6-三磷酸仍能结合到植酸酶的浅裂缝旁边，但是没有磷酸面对活性部位，因此肌醇-2，4，6-三磷酸是水解植酸酶的最终产物。同样道理，植酸可以通过第一位和第三位磷酸结合在酶的浅裂缝旁边，这时最终产物为肌醇-1，3，5-三磷酸。
Shin等[7]在研究植酸与淀粉液化芽孢杆菌植酸酶结合时，认为植酸是个大分子，而淀粉液化芽孢杆菌植酸酶的活性部位的裂缝比较狭窄，不相邻的磷酸结合上去，会发生空间上的冲突，只有相邻磷酸基团才能同时假定为Pho1和Pho2，通过初步观察，发现只有（3-P和4-P）和（6-P和1-P）两对可假定为Pho1和Pho2，当植酸分子的第3或第6位磷酸被移走时，就允许（1-P和2-P）或（4-P和5-P）结合到活性部位，这样就形成肌醇-1，3，5-三磷酸或肌醇-2，4，6-三磷酸。
4 中性植酸酶的基因工程
由于天然菌株的产酶量低，直接用其生产出的植酸酶成本较高，从而影响了植酸酶的推广应用。随着现代分子生物学的飞速发展，采用基因工程技术手段改造产植酸酶的微生物，构建基因工程菌，提高产酶量，从而进行大规模的发酵生产已成为世界性的研究热点。
中性植酸酶的基因工程主要解决的两个问题：一是通过基因工程技术利用生物反应器提高植酸酶的表达量，克服难以大量生产及生产成本过高的问题；另一个是利用基因工程的手段在分子水平上对基因进行遗传操作，从而改善植酸酶性质不能满足动物营养及饲料加工等的问题。
4.1 在同源基因中的表达
Kim等[8]利用带有T7启动子的pET22b（+）载体，将Bacillus sp.DS11编码的植酸酶基因克隆到表达载体上，在大肠杆菌中得到了高效表达，表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的20%以上，表达产物具有生物学活性，并且耐热性有了明显提高。Kerovuo等[2]将枯草芽孢杆菌VTTE-6803的植酸酶基因phyC连同自身的信号肽在T5启动子的控制下，克隆到大肠杆菌中，表达出一个与天然植酸酶分子量相同但没有活性的蛋白质，然而将phyC基因置于果胶裂解酶（pelB）的信号肽下游，在大肠杆菌中可表达出具有活性的植酸酶，其分子量、最适pH值、最适温度都与天然植酸酶相同。
姚斌等[9]将去除信号肽编码序列的中性植酸酶基因nphy,克隆到IPTG诱导表达pTYB40载体上，在大肠杆菌中得到了高效表达，表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40%以上，表达产物具有生物学活性。Tye等[4]将来源于地衣芽孢杆菌的植酸酶基因与枯草芽孢杆菌基因利用φ105MU331原噬菌体载体系统，在枯草芽孢杆菌中得到高效表达，经沉淀及凝胶过滤后，测得表达量分别是23.6 U/mg和36.9U/mg，比原始菌株约高100倍，并且表达产物耐热性明显提高。
4.2 转基因植物中的表达
培育转基因植物，使饲料（如玉米、大麦、大豆等）本身就含有足量的植酸酶，在饲喂过程中，植酸酶在动物的肠胃中释放出来，从而省去了饲料中植酸酶的添加，这无疑是植酸酶应用的最佳方法。Yip等[10]将来源于枯草芽孢杆菌的植酸酶基因转移到烟草中。在磷酸盐缺乏的情况下，植物的生长、形态及种子的萌发都有了显著的提高，这说明了中性植酸酶在烟草中得到了高效表达，降解产生的磷酸盐足以维持烟草的基础代谢。另外，储藏在种子中的植酸酶具有很好的稳定性，室温下长期储存后，植酸酶仍具有很好的生物活性。
5 中性植酸酶研究展望
中性植酸酶研究的主要思路应集中在通过基因工程的手段克隆植酸酶基因，然后在生物反应器中高效表达植酸酶基因，以解决植酸酶在原始天然材料中含量太低而难以大量提取生产的问题；在分子水平上改造植酸酶基因，从而改变植酸酶的酶学性质如耐热性、pH 值适应性、催化活性等，提高其在饲料中使用的有效性；加强植酸酶固态发酵的研究，选择高产植酸酶的菌株，通过诱变处理和条件优化，提高菌株在固态发酵时的产酶水平；寻找可行的添加方式，在生产中既便于操作，又不会对酶活力有明显的破坏，以保证植酸酶的使用效果。
随着基因工程等生物技术的日益发展，商品化中性植酸酶的生产成本将会逐步下降，其热稳定性与饲料加工工艺间的矛盾将通过饲料加工工艺及加酶技术的改进而得到解决。从提高饲料资源利用率和畜禽水产养殖业的经济效益以及环境保护等方面来看，中性植酸酶不仅在淡水鲤科鱼类饲料中的应用具有良好前景，而且在畜禽饲料中也具有重要的应用价值。
参考文献
1 Nelson T S, Shiel T R, Weodzinski R J, Ware J H. The availability of phytate phosphorous in soya bean meal before and after treatment with a mold phytase[J].Poult. Sci., 1968, (47): 1 842～1 848
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3 Kim Y O, Kee J K, Kim H K, et al. Cloning of therostable phytase gene (phy) from Bacillus sp.DS11 and its overexpression in Escherichia coli[J]. FEMS Microbiology Letters, 1998,(162):185~191
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7 Shin S, Ha N C, Oh B C, et al. Enzyme Mechanism and Catalytic Property of β Propeller Phytase[J].Structure with Floding and Design,2001(9):851~858
8 Kim Y O, Kim H K, Bae K S, et al. Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp.DS11[J].Enzyme and Microbial. Technology,1998,(22):2~7
9 姚斌，袁铁铮，王元火，等.来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].生物工程学报,2001，17（1）：11~15
10 Yip W, Wang L, Cheng C， et al. The introduction of a phytase gene from Bacillus subtilis improved the growth performance of transgenic tobacco[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2003,(310):1 148~1 154
付石军，浙江大学饲料科学研究所，在读硕士，310029，杭州市秋涛北路164号。
孙建义，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2005-04-26 |
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