|
吴远征 车程川 李纪顺 扈进冬 张玉臻 杨合同
植酸是谷物、豆类和油料等作物中磷和肌醇的主要存贮形式[1]，同时对保持机体磷的平衡起着重要的作用。以植酸磷形式存在的磷因单胃动物体内缺乏能分解植酸磷的酶而难以被利用，从而造成许多问题：①磷资源的浪费。一方面饲料中的磷得不到有效利用；另一方面则需加入大量无机磷以满足动物对磷的需求，提高了生产成本[2]。②高磷粪便对环境的污染。饲料中85%的植酸磷被动物直接排出体外，使周围的土壤和水受到严重污染[2]。此外，植酸磷还是抗营养因子，使得单胃动物不能有效利用营养物质，从而降低了禽畜的生产效益[3]。
1 植酸酶的分类及植酸的结构式
植酸酶是催化植酸及其盐类水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。现已知道的有3种类型：肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶、肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶和非特性的正磷酸盐单酯磷酸水解酶（磷酸酶），它们分别在肌醇六磷酸的6位、3位和2位碳上水解掉一个磷酸基团（见图1）。
通常所说的植酸酶是一个广义的概念，是指与植酸分解有关的酶类，它实际上包括植酸酶和磷酸酶。而狭义上的植酸酶则不包括磷酸酶，不能像磷酸酸一样将肌醇磷酸酯彻底分解为肌醇和无机磷酸，一般含有两种组分：第一种组分最适pH值在2.5左右，称之为PhytB，适合动物胃中pH值2.5的环境；第二种组分最适pH值在5.5左右，称之为PhytA，主要在动物的肠道中起作用[4]。
2 植酸酶在商品化的过程中存在的主要问题
目前微生物植酸酶已可以商品化生产，把植酸酶作为饲料添加剂已应用于实际生产，但仍然存在阻碍其广泛应用的技术难题，其中最主要的是植酸酶的耐热性问题。现有的用于商品化的植酸酶虽然具有较强的耐热性，但在70℃下制粒试验表明，其活性损失25%，80℃以及更高的温度使酶活损失更大[5]，而高温制粒和高温消毒是现代饲料工业中常见的加工工艺，因此推广利用的植酸酶必须具有良好的热稳定性。但另一方面，饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性，因为饲料用酶最终的作用场所在动物的肠道中，一般在37℃左右。现有的植酸酶通常都存在这样一种矛盾，即耐热性好但在37℃时的酶活不高，或者是37℃时酶活高却不耐高温。此外，适宜的pH值、植酸酶的产量以及植酸酶的存储和饲料中的添加量等问题，也是植酸酶在商品化生产过程中需要解决的问题。
3 植酸酶耐热性的研究进展
酶的失活因素很多，其中温度是造成酶失活的重要因素，如何提高酶的耐热性问题一直都是一个亟待解决的课题。植酸酶在温度较高的情况下酶活损失很大，是商品化生产植酸酶面临的最主要的问题。鉴于植酸酶对提高畜禽业生产效益和降低植酸磷对环境的污染有着重要意义，许多科研单位都作了大量的工作，以期能解决植酸酶的耐热性问题。
目前，人们从不同的方面对植酸酶的耐热性进行了许多富有成效的研究，使植酸酶已经可以用于商品化的生产。
3.1 筛选产耐热植酸酶的菌株
从自然环境中筛选优良菌株是一种传统的途径。1997年Pasamontes 等从Aspergillus fumigatus 中分离到一种常温的、具有极好热稳定性的植酸酶，在100℃下处理20min，酶活性丧失不到10%。但由于它的最适作用pH值为6.5～7.5，不适合在单胃动物肠胃的酸性环境中起作用[6]。从嗜温微生物 Myceliophthora thermophia、A.terrus等中分离到的高温植酸酶最适温度在70～80℃，虽然具有很好的耐热性，但在37℃下的酶活很低，尚不能作为商品用酶[2]。香港大学的Tye AJ、Siu FK等从Bacillus subtilis168和B. licheniformis中发现两种新型热稳定性的植酸酶，即使在Ca2+浓度很低、pH值中性的条件下，95℃保温10min后仍能恢复80%的初始酶活[7]。University of Limerick的Casey A和Walsh G从A.nigerATCC 9142分离得到的植酸酶在80℃比两种商品化植酸酶有更高的热稳定性，这种植酸酶酶活能被Ca2+所抑制[8]。以上这些植酸酶尽管在pH值或者其它方面还不适合于商品化生产，但是已经具备了很高的热稳定性。利用分子生物学方面或者传统的诱变技术对其改造，应该可以得到较好的商品化用酶。
3.2 添加保护剂以提高植酸酶的耐热性
多羟基化合物可以通过氢键与植酸酶的酶蛋白表面分子相联接，也可以通过氢键有效的与外部水分子相连接，使酶蛋白分子稳定。段学辉等比较了3种不同类型的植酸酶制剂，发现添加海藻酸钠、无机盐和多羟基化合物颗粒化的植酸酶具有更高的热稳定性，在95℃高温下处理20min，酶活基本能保持在80%以上，比液体酶和普通固体化处理的植酸酶制剂提高了50%[9]。台湾学者将高粱糖浆废弃液和淀粉的混合物添加到植酸酶溶液中，在80℃时处理10min，仍有67%的酶活；而未加保护剂的酶在此温度下完全失活，这是一种非常经济的方法[10]。此外人们发现添加无机盐对植酸酶有保护作用。Yang Mun Choi从Bacillus spKHU-10菌株分离到的植酸酶在加入一定量的Ca2+后，60℃保温10min，残余酶活为98%；而未加Ca2+的相对酶活几乎为零[11]。段学辉等在对甲醇酵母植酸酶热稳定性的研究中发现，加入10mmol/l的CaCl2，能明显提高植酸酶的热稳定性，80℃保温15min，其残余酶的酶活可达原液的77.8%[9]。荷兰的Gist公司发现，MgSO4和ZnSO4可以明显提高植酸酶的耐热性[12]。而欧洲的BASF公司和NOVO公司发明了制备包被型的含酶颗粒，经90℃高温处理30s，酶活残留率达93%，而未包被的酶仅有20%[13]。
3.3 分子生物学方法对植酸酶进行分子改造
在自然环境中很难获得一种热稳定性强的工业化用酶，利用分子生物学方法对现有的优良菌株进行基因工程方面的改造，是获得热稳定性突变株的便捷途径。
3.3.1 对植酸酶分子进行蛋白质修饰，特别是糖基化修饰
蛋白质在完成翻译后最主要的修饰是糖基化修饰。试验表明，糖基化修饰对于植酸酶耐热性的提高是有作用的。Han Yanming等把A.niger phyA基因在毕赤酵母中表达，得到的新植酸酶比天然植酸酶分子量大，最适作用温度比原来提高了2℃。这表明，糖基化程度对植酸酶的热稳定性是有影响的[14]。
3.3.2 利用定点突变技术对植酸酶进行改造
Rodriguez等对E.coli pH值2.5酸性磷酸酶进行定点突变，试验表明，用天冬氨酸替代酶蛋白多肽链中的几个氨基酸残基，增加酶分子潜在的糖基化位点的数目，突变体基因在毕赤酵母中表达，得到了糖基化程度、酶活性及热稳定性改变很大的突变体植酸酶[15]。近年来的研究也表明，单一氨基酸的替换可以改变酶蛋白的热稳定性，尤其是脯氨酸残基对改善热稳定性的作用尤为显著[16]。
3.3.3 共同序列理论的应用
瑞典科学家Lehmann M等通过对13株真菌的植酸酶的蛋白质序列的比对，设计出含有共同序列的植酸酶，令人意想不到的是该植酸酶的变性温度比原来的13种植酸酶提高了15～22℃[17]。Peng RH等同样利用这种方法合成了一段热稳定性高的1.3kb的植酸酶，90℃保温80min，仍能剩余40%的酶活，该基因已在毕赤酵母中表达，经60h发酵后，酶活可达130 000U/ml，具有广阔的商业应用前景[18]。
3.4 植酸酶耐热机理的研究
3.4.1 改变植酸酶蛋白质氨基酸分子的长度
黄遵锡等将A.ficuumNRRL3135植酸酶基因的+159～+662位点之间的503bp长度的功能区域在酿酒酵母中表达，获得的新植酸酶的最适反应温度也是55℃，但耐热性大为下降，80℃作用2min后，残余酶活7%；原始菌株产生的植酸酶80℃处理2min后，残余酶活11%。该结果一方面说明该区域是植酸酶的酶催化活性功能区；另一方面，新酶对温度的敏感性则说明，没有表达的那段多肽对整个植酸酶蛋白的构象稳定性是起重要作用的[19]。
3.4.2 植酸酶分子空间构象的推测
韩国的Ha NC等研究了热稳定性的植酸酶TS-phy晶体在Ca2+满负荷的情况下的空间结构，该植酸酶在有Ca2+存在的情况下热稳定性会进一步提高。研究结果发现，植酸酶结构的形状很像螺旋桨，周围分布有6个叶片，每个叶片都是一个高度弯曲的薄片，由4～5个联结方式完全相同的反螺旋β-折叠束组成，它的分子内束缚着6个Ca2+，其中3个与联结点有较强的亲和力，主要起调节催化作用，这6个Ca2+将阴离子占优势的一个凹陷处形成一个比较适宜的电解液环境，以便束缚植酸。这种晶体机构模型在一定程度上解释了高温下Ca2+对某些植酸酶的保护作用，但是否是直接影响酶的热稳定性的原因，有待于进一步证实[20]。
3.4.3 共同序列理论的验证
Lehmann M等利用定点突变和多点突变技术对植酸酶热稳定性的获得进行了研究。通过6种植酸酶的氨基酸序列被新植酸酶共同序列10和11中的一条或两条的38个氨基酸残基所替代，使共同序列10比共同序列1在热稳定性上提高了7.4℃。利用定点突变以检测这38个氨基酸替代过程中的大部分的热稳定性效果，稳定和不稳定都被验证了，但所有的对热稳定性的影响都小于3℃。在共同序列1中，大量突变子被置换成稳定的氨基酸序列所得到的重组子，其变性温度从78℃提高到88.5℃；另一方面，4个不稳定氨基酸的回复突变和额外稳定氨基酸的插入，使植酸酶10的变性温度从85.4℃提高到90.4℃。试验结果表明，植酸酶热稳定性的获得是源自大量氨基酸替换中的微小提高而得到的重组子，而非一个或多个显性突变的随机引入的结果。试验结果有效的支持了蛋白质热稳定性工程的共同序列理论，也为植酸酶热稳定性的分子改造提供了一条捷径[21]。
3.4.4 植酸酶空间二级结构的改变
Jermutus等按照耐热性较好的A.niger植酸酶的晶体结构，将A.terrus植酸酶表面的一个二级结构α螺旋用A.niger植酸酶上相应长度的一段序列替换，获得了酶活性未变而热稳定性提高的新植酸酶。尽管新酶中只有A.niger植酸酶31个氨基酸序列，但新酶的热稳定性与A.niger植酸酶相似。说明这种热稳定性一定程度上是该二级结构作用的结果[22]。
3.4.5 对植酸酶在一定温度下的荧光分析
Wang XY等植酸酶的变性过程进行了研究，一般认为植酸酶的热变性是可逆的，但是对于酸性磷酸酶的热变性可以分成两个阶段：当温度在45℃和50℃之间时，酸性磷酸酶的热失活是不可逆的，并有残余的酶活；当温度高于55℃时，该酶就完全不可逆的失活。利用荧光分析表明，当用60℃以下温度对该酶处理60min，酶的构象没有发生明显的变化；当温度高于60℃时，荧光红移的放射密度降低，酶的活性降低比构象的改变缓慢。这表明该酶的酶活位点位于该酶相对脆弱的区域[23]。
4 植酸酶耐热性研究的展望
从现在的研究成果来看，虽然获得了许多耐热植酸酶，但是植酸酶的耐热性研究还是处于知识的积累阶段，特别是植酸酶耐热机理的研究更是处于初步阶段。许多问题值得我们进一步去研究，譬如如何从理论上解释植酸酶在37℃和高温时酶活相差太大的矛盾以及某些植酸酶在高温时酶活有回升的现象[6]。这些问题的探讨不仅有助于解决植酸酶的耐热机理，而且对其它酶的热稳定性机理的研究也是有一定意义的。此外，已从嗜温微生物中发现多种高温植酸酶，对它们的结构和热稳定性的研究将为植酸酶的热稳定改造提供信息[6]。
参考文献
1 Graf E,J. Am. Oil. Chem. Soc.,1983,60:1 861～1 867
2 姚斌,范云六.植酸酶的分子生物学与基因工程[J].生物工程学报,2000(16)：1
3 Nelson T S,Shieh T R,Wodzinski R J et al.Poult. Sci.,1968,47:
1 842～1 848
4 夏立秋,程海娜,陈宇，等.植酸酶及基因工程研究进展[J].激光生物学报,.2001(10)：3
5 王红宁,黄勇,陈惠，等.饲用微生物植酸酶的研究进展[J].国外畜牧学-饲料,1998,5
6 Pasamontes,Haiker M,et al.Appl. Environ. Microbiol.,1997,63(5):1 696～1 700
7 Tye AJ,Siu FK.Appl. Microbiol. Biotechol.,2002,59(2～3):190～197
8 Casey A,Walsh G.Bioresour. Technol.,2003,86(2):183～188
9 段学辉,孙京超,曾文兵.甲醇酵母植酸酶的热稳定性[J].南昌大学学报,2003(27)：1
10 Chang-Chih Chen,Ching-Tsan Huang.Biotechnology letter,1999,23:331～333
11 Yang Mun Choi,Hyung Joo,Journal of Protein Chemistry,2001,20(4):287～292
12 世界专利,WO98/55599
13 世界专利,WO97/16076
14 Han Yanming,Wilson DB,Lei XG. Appl. Environ. Microbiol.,1999,65(5):1 915～1 918
15 Rodriguez E,Wood ZA,Karplus PA.Arch Biochm. Biophys，2000,382(1):105～112
16 邢自力,陈华友，等.植酸酶及其热稳定性研究进展[J].中国生物工程杂志,2003(23)5
17 Lehmann M,Pasamontes L,Lassen SF,Wyss M,Biochim. Biophys. Acta.,2000, 29(2):1 543
18 Peng Ri-He,Xiong Ai-Sheng,Li Xian,et al.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2002,34(6):725～730
19 黄遵锡,赵明哲,李凤梅，等.无花果曲霉(A.ficuum)植酸酶功能区基因的克隆及生物学活性的测定[J].云南师范大学学报,2001,21(4):46～53
20 Ha NC,Oh BC,Shin S.Na. Struct. Biol., 2000,7(2):147～153
21 Lehmann M,Loch C,Middendorf A,Protein Eng.2002,15(5):403～11
22 Jermutu L,Tessier M,Pasamontes L,et al.J. Biotechnol.,2001,85(1):15～24
23 Wang XY,Meng FG,Zhou HM.J. Biochem. Cell Biol.,2004,36(3):447～459
（编辑：高 雁，）
吴远征，山东省科学院生物技术研究中心，助理研究员，250014，山东省济南市历下区科院路19号。
车程川，曲阜师范大学生命科学学院。
李纪顺、扈进冬、杨合同（通讯作者），单位及通讯地址同第一作者。
张玉臻，山东大学生命科学学院。
收稿日期：2005-08-22
|
相关信息
