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付五兵 朱 涛 张勤良 胡叶碧
摘 要 对Bacillus subtilisT15生产的木聚糖酶作了部分酶学性质考察，研究表明：该酶是一种中性木聚糖酶，最适pH 值为6.4，pH值稳定范围为5.6～8.0；最适温度为55℃，酶液在40～50℃处理4h后活力保持100%，含水量17%～20%的酶泥在85℃条件下2.5min活力保持67.4%；对燕麦木聚糖的主要降解产物为聚合度2～5的木寡糖。在考察酶学性质基础上，对该酶作了在禽饲料中的初步应用实验。饲养试验表明，在禽饲料中添加0.002％该酶能提高料肉比9.94%，饲养效果显著优于对照组（P<0.05）。
关建词 木聚糖酶；酶学特性；禽饲料
中图分类号 S816.32
饲料原料中含有大量的非淀粉多糖（NSP），NSP是植物细胞壁的组成成分，不能被消化液水解，大分子消化酶不能通过细胞壁进入细胞内，因而细胞内容物形成一种包被结构，不能被充分消化利用。木聚糖是植物细胞壁中除纤维素外的第二大组成成分，主链由β-1，4-吡喃木糖残基组成，侧链成分因植物种类而异比较复杂，主要是各种杂多糖残基，包括4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、L-呋喃阿拉伯糖以及乙酰化木糖[1]。
我们将自然界降解木聚糖的酶统称为木聚糖酶，以内切β-1，4-木聚糖酶起主要作用，外切β-木聚糖酶、呋喃阿拉伯糖酶、葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶等起辅助作用。内切β-1，4-木聚糖酶能快速、随机地切断木聚糖主链内的β-1，4-糖苷键连接，为辅助酶提供大量剪切位点。实际应用中高β-1，4-木聚糖酶活力的木聚糖酶制剂能将底物降解成大量对人、畜有生理功能的木二糖和木三糖等低聚糖。通过在饲料中添加木聚糖酶帮助动物有效降解非淀粉多糖是提高饲料利用率，降低动物患病率的可行途径，目前已有很多这方面的研究和应用[2]。
本文探讨了由Bacillus subtilisT15生产的木聚糖酶的pH值特性、温度特性、主要降解产物以及用它制成的固体酶制剂在禽饲料中的初步应用。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
pHS-3C精密pH计，±0.01pH值，上海雷池仪器厂；紫外分光光度计751GD，上海分析仪器厂；电热恒温水浴锅，上海实验仪器厂；自动平衡微型离心机LDZ4-0.8，北京医用仪器厂。
1.2 实验材料及试剂
Na2HPO4·12H2O，A.R.；NaH2PO4·2H2O，A.R.；3,5-二硝基水杨酸，A.R.；柠檬酸，A.R.；木糖，Sigma x-3877；酒石酸钾钠，A.R.；燕麦木聚糖，Sigma x-0627；甘氨酸，A.R.；鸡饲养对照商业酶，采用市场占有率较大的某进口酶制剂；木聚糖酶，由Bacillus subtilisT15 经液体深层发酵后提纯、干燥、复配后制得（湖南尤特尔生化有限公司生产，活力45 000IU/g）；酶液，精密称取1.000g 木聚糖酶，用0.1mol/l的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH值6.5）约80ml搅拌10min，定容至100ml，摇匀，离心后取上清液备用。
1.3 酶活测定
1.3.1 酶活单位定义
在一定温度、pH值条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活单位（IU）。
1.3.2 酶活力测定
采用DNS法[3]（稍作改动）。
1.3.2.1 1.0%底物配制
精密称取燕麦木聚糖1g, 精确至0.000 2g，溶于40ml的0.1M氢氧化钠溶液中，室温下磁力搅拌12h以上。用3M盐酸溶液或3M氢氧化钠溶液调pH值为6.50。加0.5M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中性缓冲液至90ml，再调pH值为6.50，然后用0.05M的中性缓冲液定容在100ml的容量瓶中。标记为1.0%中性木聚糖酶底物，同时标记pH=6.50、配制日期。保存在4℃的冰箱内。
1.3.2.2 DNS试剂的配制
准确称取酒石酸钾钠300.0g完全溶于500ml蒸馏水中，标记为A试液。准确称取氢氧化钠16.0g完全溶于250ml蒸馏水中，标记为B试液。 准确称取3，5-二硝基水杨酸10.0g完全溶于B试液中，标记为C试液。将C试液和A试液混合用蒸馏水定容至1 000ml，标记为DNS试剂。DNS试剂用棕色瓶放置7d后，用细纱布过滤蔽光保存。
1.3.2.3 活力测定步骤
在0.5ml中性木聚糖底物中加入0.5ml稀释好的待测酶液，50℃水浴中反应15min，立即加入3ml的DNS试剂，沸水浴中煮10min。水浴冷却至室温后，测OD520值。调整稀释倍数控制OD值在0.2～0.4范围。
1.4 pH值特性考察
1.4.1 pH值对酶活力的影响
配制pH值3.2～9.6的缓冲液，在不同pH值条件下反应，测定酶活力，以酶样的最大酶活为100，在其它条件下的酶活相对最大酶活的百分数即为该酶的相对活力。
1.4.2 pH值稳定性
将酶在不同pH值缓冲液中放置2h（4℃）后在50℃、pH值6.5条件下测定相对活力。
1.5 温度特性考察
1.5.1 温度对酶活力的影响
将酶液用pH值6.5的磷酸盐缓冲液稀释后在35～70℃的不同温度条件下与底物反应测定相对活力,确定温度对酶活力的影响。
1.5.2 湿热稳定性
将酶液分别置于40、50、60、70℃水浴不同时间后,在pH值6.5、50℃条件下测定保留的相对活力。准确称取1.000g 酶粉加入13%的水（加后含水量17%～20%），充分搅拌后密封，置4℃冰箱平衡12h，再于85℃恒温干燥箱分别处理2.5、5、7.5、10min，立即提取，在pH值6.5、50℃条件下以未经处理的酶活为100，测定其保留的相对活力。
1.6 降解产物的考察
用薄层色谱法测定pH值6.5、50℃条件下降解燕麦木聚糖所生成的不同低聚糖。
1.7 饲养试验[4]
选用肉仔鸡540只,随机分成3组,2个试验组，1个对照组,每组3个重复,每个重复60只。对照组饲喂基础日粮,试验组1饲喂基础日粮＋0.002％试验木聚糖酶，试验组2饲喂基础日粮＋0.5‰的市售木聚糖酶,两组饲料所加酶活水平相同。3个组试验条件一致,自由采食、自由饮水,分别于第1d和试验结束时称重、统计采食量、计算增长率和料肉比。
2 结果与讨论
2.1 pH值特性
2.1.1 pH值对酶活力的影响（见图1）
由图1可知,该酶的pH值范围较宽，从pH 值5.6～7.2相对活力在90%以上，在pH值6.4处有最大值，因此其最适pH值在6.4左右。超出这一范围，活力快速下降,其原因是：一方面，可能与pH值对酶蛋白活性部位中质子移变基团离子化状态的影响有关。酶活性部位中质子移变基团可能参与保持活性部位正确的构象，酶与底物的结合和底物转变成产物[5]。在较高或者较低的pH值范围内，pH值直接影响着该酶活性部位的正确构象，导致了该酶与底物不能很好地结合，从而影响了底物被酶水解，最终使催化活力有不同程度地下降。另一方面，可能还与该酶对pH值的稳定性有关。
2.1.2 酶的pH值稳定性（见图2）
从图2可看出,该酶具有较宽的pH值稳定范围：在pH值5.6~8.0条件下2h能保持80%以上活力，在pH值8.8以上，随着pH值上升酶的稳定性变差，可能是由于体系中的OH-会破坏或干扰部分维持木聚糖酶空间构象的氢键和疏水相互作用力， OH-的浓度上升，破坏或干扰氢键和疏水相互作用力的能力加强，导致木聚糖酶稳定性下降。当pH值在5.6以下时酶的稳定能力迅速下降，说明在此pH值以下酶蛋白存在不可逆变性[5]。
由图1和图2可知，该酶在pH值5.6～8.0范围内具有较高活力和稳定性，因此是一种中性木聚糖酶。
2.2 温度特性（见图3、图 4、图5）
由图3可知，这种中性木聚糖酶在40~60℃具有70%以上活力，55℃具有最高活力。图4表明,酶液在50℃以下稳定，40~50℃条件下4h能100%保持活力，60℃处理20min保留80％活力，但当酶液温度达到70℃时酶蛋白迅速失活。图5 表明，高温湿热处理对酶蛋白的影响比低温湿热大得多，该酶具有较好的热稳定性：含水分17%～20%的酶在85℃条件下2.5min能保留67.4%的活力，用于饲料不会因制粒时的高温湿热而活力大幅下降，从而能基本保证实际饲用效果[6，7]。
酶变性是由于其蛋白质分子空间三维结构的变化引起的，即构象改变从而导致酶活性部位的结构受到破坏，酶催化能力降低或丧失。在热作用下，酶蛋白的运动能力加强，导致酶的构象展开，并进而引起非共价键的断裂，于是酶部分失活，温度越高，热作用时间越长，酶失活越严重。水能显著地促进蛋白质的热变性，水合作用和水部分地穿透至蛋白质结构的空洞表面导致蛋白质肿胀，提高了多肽链的移动性和柔性，使其可以采取动力学上更为熔融的结构，从而表现出比干热条件下更大的热不稳定性[14]。
2.3 主要降解产物
酶对燕麦木聚糖的降解产物随时间变化色谱图见图6。
研究木聚糖酶对燕麦木聚糖的主要降解产物见图6。由图6可知：随着降解时间的增加低聚木糖产量不断增加；当酶对底物的处理达到18h后， 90%以上降解产物由木二糖、木三糖、木四糖和木五糖组成；处理24h的产物与18h时接近，未见单糖生成，因此可断定酶系中内切β-1，4-木聚糖酶活力较高。低聚木糖是一类功能性寡糖，被称作“益生元”，具有如下基本功能：促进动物后肠道有益菌的增殖，抑制有害菌的增殖和生长,是提高动物健康水平的微生态调节剂；促进有害菌的排泄,作为免疫佐剂和激活动物特异性免疫等途径,提高其整体免疫能力,是防治疾病发生的免疫增强剂[8]。
2.4 中性木聚糖酶在肉仔鸡日粮中的应用
中性木聚糖酶在肉仔鸡日粮中的应用试验，结果见表1。
表1的饲养结果表明，试验组的饲养效果显著优于对照组（P<0.05），两个试验组改善的料肉比率分别为9.94％和8.05％，试验1组改善的料肉比率比试验2组高1.89%, 料肉比低2%，这说明在添加同等酶活力水平条件下，试验木聚糖酶在提高鸡的饲养效率上具有一定优势。在饲料中添加适量的木聚糖酶降解非淀粉多糖能有效地降低饲料粘性，减少畜禽肠道疾病，增进畜禽健康，提高成活率，从而提高饲养效率[9-11]。动物的主要消化场所在小肠的前中段，而这一段肠液的pH值处于中性范围，因此具有较宽pH值范围和温度范围的中性内切木聚糖酶能更好地满足动物降解抗营养因子的需要。
3 结论
Bacillus subtilisT15生产的木聚糖酶与普遍报道的酸性木聚糖酶相比[12，13]，是一种具有较宽的pH值范围、温度范围和稳定范围的中性木聚糖酶。其最适pH值为6.4，在pH值5.6～7.2范围内相对活力大于90%；最适温度为55℃，从40℃到65℃都具有较高活力（70％以上）；50℃以下稳定，含水分17%～20％的酶泥经85℃处理2.5min能保持67.4％的活性。该酶还具有比较高的内切β-1，4-木聚糖酶活性，能较好地在动物消化道中发挥作用，提高饲养效率。
参考文献
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付五兵，湖南尤特尔生化有限公司，工程师，414009，湖南省岳阳市云溪工业园。
朱涛，单位及通讯地址同第一作者。
张勤良、胡叶碧，江南大学食品学院。
收稿日期：2005-05-13
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