王芸芸 刘利军 王 丹 刘宁普
摘 要 试验研究了甘草废渣固体发酵工艺，并提取发酵后甘草渣中的总黄酮，测定主产酶活力，确定最佳发酵工艺为碳源：甘草渣：麸皮=6：4，氮源：(NH4)2SO4 2.0%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.1%；接菌量6%，加水量1.2：1，发酵时间为3 d，提取溶剂50%的乙醇。
关键词 甘草渣；黑曲霉；总黄酮；纤维素酶；木聚糖酶
中图分类号 S816.6
我国是世界上认识和研究甘草最早的国家。东汉的《神农本草经》中即有记载。传统医学认为其有益气补中、清热解毒、祛痰止血、缓急止痛、调和诸药等功能，故有“十药九草”之说。
近年来，甘草药材由于遭到过度采挖，资源急剧减少，合理利用和保护甘草资源已十分必要。甘草提取甘草酸后，剩余的药渣通常作为废弃物遗弃，有关甘草渣的综合利用，还未见文献报道。本文研究了以甘草渣为主要原料，通过黑曲霉菌株的固体发酵，利用微生物产生的纤维素酶和木聚糖酶破坏植物细胞的纤维结构，促进甘草中有效成分的溶出，同时确定了最佳发酵工艺，并测定了最优工艺下主产酶活力，以期将甘草渣作为饲料添加剂，应用于动物营养饲料的开发中，进而为甘草渣的资源化利用开辟一条新的思路。
1 材料与方法
1.1 菌种
黑曲霉(Aspergillus niger)为微生物实验室保存菌株。该菌种在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基斜面上培养3 d,待孢子形成后,置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2 材料与仪器
甘草渣（宁夏盐池）、麸皮、木糖（分析纯）、木聚糖（分析纯）、葡萄糖（分析纯）、(NH4)2SO4（分析纯）、95%乙醇（分析纯）、KH2PO4(分析纯)、MgSO4（分析纯）；TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用有限责任公司)、PHS-2数字酸度计（杭州东星仪器厂）、BS224S电子天平(北京赛多利斯科学仪器公司)、立式压力灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、全自动新型生化培养箱（上海智成分析仪器制造有限公司）、洁净工作台（苏净集团安泰公司制造）。
1.3 固态发酵[1]
在250 ml三角瓶中加入一定量的甘草渣和麸皮，料厚约3 cm。加入适量水搅拌均匀，121 ℃高压灭菌20 min,冷却至30 ℃,黑曲霉孢子用无菌水配制成悬浮液,在三角瓶中接种0.7 ml,于30 ℃下静止培养,定期取样测定其木聚糖酶活力、纤维素酶活力和总黄酮含量,每组做3个平行实验,结果取其平均值。发酵结束后,提取并测定总黄酮含量及主产酶活力。
1.4 木聚糖酶活力和纤维素酶活力的测定
木聚糖酶活力和纤维素酶活力都是采用DNS法进行测定，一个木聚糖酶活力单位（U）代表每分钟降解底物木聚糖释放出1.0 μmol还原糖(以木糖计)所需的酶量。CMC酶采用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为底物测定活力,在50 ℃、pH值4.8下每小时由底物形成1.0 mg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U) 。
1.5 甘草总黄酮的提取
称取10 g甘草渣发酵曲,用120 ml 50%的醇于50 ℃恒温水浴下提取4 h,过滤得滤液。
1.6 紫外分光光度法测定滤液中总黄酮的含量
以芦丁为标准品,在其最大吸收510 nm下测定吸光度值,并根据制定的标准曲线计算总黄酮的含量。
2 结果与讨论
2.1 常规醇提取甘草渣中的甘草黄酮
称取10 g甘草渣,加入20倍的醇,回流提取2 h,提取3次，合并提取液，取样结合标准曲线，参考相关文献，根据以下公式[2]计算甘草渣子中的总黄酮含量为1.720 5%。
C(%)=（V×X）/（100×A×W）×100%
式中：X——比色液中黄酮的含量；
V——提取液总体积；
A——移取提取液的体积；
W——甘草渣的重量。
2.2 最优工艺的确定[3-4]
讨论碳源、氮源、水料比、发酵时间、接种量对总黄酮含量以及酶活力的影响，确定出了最佳工艺为碳源：甘草渣：麸皮=6：4,氮源：(NH4)2SO4 2.0%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%;接菌量6%，加水量1.2：1，发酵时间为3 d，提取溶剂50%的乙醇。
2.3 最优工艺下甘草总黄酮的测定
最优工艺条件下,所测得总黄酮含量为1.984 9％。
2.4 最优工艺下酶活力的测定
2.4.1 木聚糖酶活力的测定[5]
精确称取经“四分法”采样取得的酶样品1.000 0 g,用10 ml pH值为4.8的乙酸缓冲液置于4 ℃冰箱浸泡12 h，浸泡液用脱脂棉过滤，得待测酶液。
① 标准曲线的制作:分别吸取1.0%的标准木糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml置于10 ml容量瓶中,用蒸馏水制成每毫升分别含有木糖100、200、300、400、500 μg的标准液。各取不同浓度标准液1 ml置于试管中，加DNS试剂3 ml混匀，于沸水浴中准确反应5.0 min(从试管放入重新沸腾时算起),取出后立即放冷水浴中冷却至室温,以空白管调零,在520 nm处比色，以所得光密度OD值为纵坐标，以对应的标准木糖的浓度为横坐标,绘制标准曲线，得回归线方程为Y=-0.128 8+0.005 51X，r=0.999 25，线性关系良好。
② 空白的制作:取1 ml蒸馏水代替标准木糖溶液,加DNS试剂3 ml混匀,于沸水浴中准确反应5.0 min（从试管放入重新沸腾时算起），取出后立即放冷水浴中冷却至室温，备用。
2.4.2 样品的测定
待测酶液用0.05 mol/l、pH值4.8的乙酸缓冲液稀释适当倍数(控制测定OD值在0.2~0.6之间)，取经40 ℃预热的此稀释液1.0 ml,加入经40 ℃预热的木聚糖溶液1.0 ml（每个样品至少同时做三个平行试验），混匀，40 ℃恒温准确反应30 min，立即加入DNS试剂3 ml混匀，于沸水浴中准确反应5.0 min，取出后立即放冷水浴中冷却至室温，以空白管调零，在520 nm处比色。测定结果如表1所示。
① 空白的制作：取1.0 ml经40 ℃预热的1.0%木聚糖溶液置于试管中，40 ℃恒温准确反应30 min，加DNS试剂3 ml，待测稀释酶液1.0 ml，混匀，于沸水浴中准确反应5.0 min，取出后立即放冷水浴中冷却至室温，以空白管调零，在520 nm处比色。
② 活力计算：
式中：r——酶液稀释倍数；
Df——标准曲线上查得的还原糖的量(μg/ml)；
t——酶作用时间(min)。
2.4.3 纤维素酶活力的测定[6]
2.4.3.1 酶液的制备
精确称取经“四分法”采样取得的酶样品1.000 0 g,用10 ml pH值为4.8的缓冲液用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液浸泡1 h，浸泡液用脱脂棉过滤，得待测酶液。
取酶液1 ml加入4 ml CMC-Na在50 ℃水浴中保温30 min，后加入5 ml DNS试剂在沸水浴中反应5.0 min，冷却至室温；空白为5 ml蒸馏水加入5 ml DNS试剂沸水浴5.0 min。
2.4.3.2 标准曲线的绘制
用蒸馏水配置分别含有0、40、80、100、160、200、240 μg/ml 的葡萄糖溶液,各取5 ml葡萄糖溶液加入5 ml DNS试剂沸水浴5.0 min。冷却至室温，在500 nm处比色。绘制标准曲线，得回归线方程为Y= -0.619 2+0.009 33X，r=0.999 92,线性关系良好。结果见表2。
3 前景展望
甘草是一种药用价值相当高的植物，经过发酵的甘草渣，纤维素酶活力达到762.083 U/ml，木聚糖酶活力6 009.68 U/ml ，而且在发酵产酶的过程中破坏了细胞的纤维结构，促进有效成分的溶出，经醇提后仅甘草黄酮的量比发酵前增加了15.37%， 因此发酵后甘草渣中各种药用成分的溶出量较发酵前都有所提高，如果将其添加到动物饲料中不仅可以增加饲料的营养成分，同时甘草中的独特的药用成分还可以增强动物机体的免疫力，进而可以提高饲料的利用率，解决了甘草废渣资源化利用和环境污染的问题。
参考文献
[1] 刘德海，安明理，等，固体发酵复合酶最佳工艺条件研究[J]. 饲料工业, 2004,25（6）：12－17.
[2] 王应强，张静，段玉峰. 超声波提取甘草黄酮的工艺研究[J]. 粮油食品科技,2006,14(3):42-43.
[3] 邬敏辰，李江华，等.黑曲霉固态培养生产纤维素酶的研究[J]. 酿酒，1997（6）:5-9.
[4] 施英英，夏黎明. 葛根渣固态发酵产异黄酮的研究[J]. 林产化学与工业，2007，27（1）:57-60.
[5] 王清吉，尹西竹,等. DNS法测定饲用木聚糖活力[J]. 兽药与饲料添加剂，2000，5（1）:10.
[6] 夏服宝，邱雁临,等.纤维素酶活力的测定条件研究[J]. 饲料工业，2005，26（16）：23-26.
（编辑：刘敏跃，）
王芸芸，宁夏大学化学化工学院，750021，宁夏银川。
刘利军(通讯作者)、王丹、刘宁普，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2008-12-29
★ 宁夏回族自治区自然科学基金(No.2007Zr060)资助项目 |
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