异育银鲫（Carassius auratus gibelio）是用黑龙江省方正县双风水库的银鲫（简称方正银鲫）作为母本，用兴国红鲤作父本，经人工授精和异精雌核发育而得的子代，具有适应性强、食性广、耐低氧、抗病力强、肉质鲜美等优点，同时也是一种生长快、产量高，易于养殖的鲫鱼。小肽作为饲料添加剂应用在水产养殖上,可满足水产动物对蛋白质的需求,促进机体生长,增强水产动物的免疫力,提高其成活率,提高水产动物的采食量和饲料消化率。许培玉等[1-2]试验表明，添加1.5%小肽制品可显著提高南美白对虾的相对增重率、体长增长率、降低饲料系数、提高成活率;凡纳滨对虾饲料中添加小肽制品后,除了肝、胰腺的类胰蛋白酶外,各种消化酶活性随着小肽添加量的增加逐渐提高,添加量达到适宜水平(1.0%、1.5%)时,消化酶的活性也达到最大,亦可证实小肽制品可剌激消化酶的分泌,从而促进营养物质的消化吸收。李清等[3]试验结果表明,随着小肽用量的增加,成鲤血液中免疫球蛋白IgM和补体C4逐渐升高。邓岳松[4]试验结果表明,饲料中添加植物活性小肽可以提高史氏鲟稚鱼的摄食量,提高饲料转化率和免疫力。本试验采用梯度法,研究异育银鲫饲料小肽的最适添加水平,为节约饲料原料资源、降低饲料成本、科学地使用饲料添加剂日粮提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验鱼
选择均重为(16.0±0.2) g体质健壮的异育银鲫（盐城市郊区某池塘当年孵化的同一批鱼）400尾，用5%的食盐水消毒后暂养备用。试验为7月16日开始，8月30日结束，共45 d。
1.2 试验设计
将240尾体质健壮的异育银鲫分为4组，分别为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组，每组60尾，每组设2个重复，初始体重差异不显著，对照组饲料中不添加小肽，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别添加2%、3%、4%的小肽来调整饲料配方。
1.3 试验饲料
在基础饲料（见表1）中分别添加0、2%、3%、4%的小肽制品（由江苏某动物保健品有限公司提供，为41%的棉粕肽），然后用逐级扩大混合的方法将饲料混合，配制成4组试验饲料，经充分混合后加工成直径为2 mm的颗粒饲料，晾干并保存于冰箱中备用，投喂时将其切成小的颗粒。
1.4 饲养管理
将鱼苗预养半个月后开始正式试验，每组2个重复，每30尾鱼饲养于0.6 m×0.6 m×0.8 m的水族箱中，采用流水循环方式，饲养45 d。水温(27.2±2.1) ℃，水经流水曝气。投饲量为鱼体重的5%~10%，每天喂3次，分别为7:00、14:30和18:00。喂完后1 h内进行排污，以免水质恶化。
1.5 试验鱼的处理
生长试验结束后，将试验鱼断尾采血后置于冰盘上解剖，取出肝胰脏、肠。将肠分为前肠、中肠、后肠，前肠为第一个弯折处之前，后肠为最后一个弯折处之后，中间段为中肠，每组5尾鱼的前肠、中肠、后肠分别合并作为一个样本。
1.6 测定指标和分析方法
1.6.1 采血一律采用断尾采血方法，在预先用1%肝素钠处理干燥的表面皿中置放抗凝血，备用。
1.6.2 血红蛋白值的测定[5]
血红蛋白（Hb）含量采用XK-2型血红蛋白仪测定。
1.6.3 红细胞的计数[6]
用血细胞稀释液将血液稀释251倍，然后用Neubarner计数板在显微镜下计数。
1.6.4 白细胞的计数[6]
用血细胞稀释液将血液稀释10.5倍，然后用Neubarner计数板在显微镜下计数。
1.6.5 血清的提取
将接触血清的1 ml一次性注射器和1.5 ml离心管等用100 mmol/l的EDTA溶液润洗，从鱼的尾动脉取血，然后5 000 r/min离心3 min，上清液置-30 ℃冰箱过夜，次日待血清解冻后，用针头挑去纤维蛋白，5 000 r/min离心3 min，上清液置4 ℃冰箱备用，使用前需摇匀。
1.6.6 葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、丙氨酸转氨酶、超氧化歧化酶（SOD）的测定均采用试剂盒法（南京建成生物技术研究所测试盒）。
1.6.7 酶液的制备
将肝胰腺、肠道样品用滤纸吸干表面水分后分别称重，用预冷重蒸水，在冰浴内用玻璃匀浆制成匀浆后，以9 000 r/min离心30 min，取上清液作酶活性测定。
1.6.8 酶活性的测定
福林-酚试剂法测定蛋白酶活性[7]。蛋白酶活性定义:在pH值3.0底物酪蛋白浓度为5 mg/ml，37 ℃下保温15 min，以每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为一个活力单位。淀粉酶活性测定用淀粉-碘显色法[8]。淀粉酶活性定义为:在pH值7.0、37 ℃条件下，30 min内1 mg组织完全水解10 mg淀粉，为一个淀粉酶活力单位。
1.7 数据统计与分析
原始数据经Excel 2003初步整理后，用SAS6.12中的单因子方差分析（One-Way Anovy）进行LSD法多重比较。显著水平为（P<0.05）。数据用平均值±标准差（Means±SD）形式表示。
2 结果与分析
2.1 小肽替代鱼粉对异育银鲫淀粉酶的影响(见表2)
由表2可知，随着小肽替代量的增加，异育银鲫的前肠、中肠、肝胰脏淀粉酶活力没有显著变化，各组间差异不显著（P>0.05）。与对照组比较，试验Ⅰ、Ⅱ组后肠淀粉酶活力显著降低（P<0.05），试验组Ⅲ差异不显著（P>0.05）。相对于对照组，试验组肠淀粉酶活力降低。以上说明小肽替代鱼粉对异育银鲫的肠淀粉酶活力产生不同程度的影响，但对肝胰脏淀粉酶活力没有明显影响。
2.2 小肽替代鱼粉对异育银鲫蛋白酶的影响(见表3)
由表3可知,小肽的添加提高了异育银鲫肠和肝胰脏中蛋白酶的活力。随着小肽替代量的增加,前肠、肝胰脏的蛋白酶活力虽有上升但没有显著变化,组间差异不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组的中肠、后肠的蛋白酶活力显著高于对照组(P<0.05),而与其它试验组差异不显著(P>0.05)。以上说明小肽替代鱼粉对异育银鲫肠蛋白酶活力产生影响，但对肝胰脏蛋白酶活力没有影响。
2.3 小肽替代鱼粉对异育银鲫血液生理指标的影响（见表4）
由表4可知,随着小肽替代量的增加,各组血液中血红蛋白值没有显著变化,差异不显著(P>0.05);甘油三酯试验Ⅰ组与试验Ⅱ组差异显著;红细胞数有下降趋势,试验Ⅰ组与对照组差异不显著(P>0.05),试验Ⅱ、Ⅲ组与对照组差异显著(P<0.05);白细胞数呈上升趋势,试验组与对照组差异显著(P<0.05)；与对照组相比,葡萄糖含量增加且差异显著(P<0.05)；总胆固醇含量降低，试验Ⅰ组与对照组差异不显著(P>0.05),试验Ⅱ、Ⅲ组与对照组差异显著(P<0.05)；试验Ⅱ组谷丙转氨酶含量最高,与试验Ⅰ组差异不显著(P>0.05),与对照组、试验Ⅲ组差异显著；超氧化歧化酶(SOD)活力有下降的趋势,试验Ⅲ组最低,与其它各组差异显著(P<0.05)。
3 讨论
3.1 小肽替代鱼粉对异育银鲫淀粉酶的影响
鱼类淀粉酶是碳水化合物水解酶类的一种，肝胰脏是淀粉酶中心生成器官，其分泌机能的强弱直接影响鱼类对食物的消化能力。淀粉酶的活性会随着不同消化器官或同一消化器官的不同部位会有所差异，这可能与其机体组织的生理功能有关[9]，本试验对淀粉酶活力测定的结果表明，异育银鲫肠道淀粉酶远高于肝胰脏，这与邹师哲等[10]对的鲤，吴婷婷等[11]对鲫、鳜和鲢鱼种，王红权等[12]对异育银鲫一龄鱼种的研究结果一致，说明肠对于碳水化合物水解能力远高于肝胰脏。本试验还表明，添加不同水平小肽替代鱼粉后，相对于对照组（不添加小肽），除后肠有所差异外，前肠、中肠和肝胰脏淀粉酶活力差异均不显著，总体呈下降的趋势，说明小肽的添加影响了异育银鲫对碳水化合物的吸收和消化。
3.2 小肽替代鱼粉对异育银鲫蛋白酶的影响
王羲强[13]报道，草鱼和银鲫肝胰脏中的胰蛋白酶活性（无论是空肠还是充满食物）总比肠内的低得多，倪寿文等[14]测得的鲢、鳙鱼结果也是如此，与本试验的试验结果一致。这说明蛋白酶的消化作用主要在肠内，一般胰蛋白酶在胰脏中是呈无活性的酶原状态，分泌到肠道内以后才被激活[15]。赵振伦等[16]研究异育银鲫鱼种消化酶活性与多种复合动物蛋白饲料关系时，发现肠组织蛋白酶活性很高。Zambohino等[17]分别用20%和40%的小肽替代鱼粉饲养海鲈3周后发现，海鲈的胰凝乳酶和γ-谷氨酰肽酶活性提高。研究得知异育银鲫鱼种肝胰脏蛋白酶活性很低，不到肠蛋白酶活性的1/20，可见饲料蛋白消化过程主要依靠肠蛋白酶的作用[18]。本试验分别添加2%、3%、4%的小肽以替代鱼粉，研究结果表明：相对于对照组（不添加小肽），中、后肠有所差异，但从测得的数据可以看出，任一水平的小肽均提高肠、肝胰脏蛋白酶活力。说明小肽能刺激异育银鲫分泌更多的蛋白酶，提高对蛋白质的的水解能力，进而提高利用效率，这与谷伟等[19]报道的小肽比氨基酸更容易、更快地被机体吸收利用，能有效刺激和诱导小肠绒毛刷状缘酶的活性上升，并促进动物的营养性康复，使存在于肠绒毛膜中酶活性提高，使酶水解蛋白的能力提高的结论相一致。
3.3 小肽替代鱼粉对异育银鲫血液生理指标的影响
鱼类血液生理指标变化与机体的新陈代谢、生理状况息息相关，因而被广泛用来评价鱼体的健康状况及其对环境的适应[20]。随饲料中小肽含量的增加，血红蛋白及白细胞值均呈上升的趋势，表明小肽能有效增加鱼体对外界环境的抵抗力，促进鱼体的健康成长；葡萄糖含量的高低反映了代谢水平的高低[21]，小肽组明显提高了血液内血糖的含量，促进机体的代谢，使新陈代谢加快，促进机体的发育；甘油三酯值过高是肝、脾等相关器官的功能遭到破坏的表现，小肽使得甘油三酯值降低，说明小肽促使机体各器官处于较佳的工作状态；丙氨酸转氨酶(GPT)在鱼体肝脏中丰富,GPT血浆水平被认为是指示肝脏损伤的指标[22]，GPT含量上升是肝脏遭到破坏的表现，试验组相对于对照组测得的值较大，表明小肽相对于鱼粉对肝脏有一定程度的破坏；超氧化物歧化酶（SOD）具有催化超氧离子自由基进行歧化反应的功能，是机体清除氧自由基的重要抗氧化保护酶，它能促使自由基的形成和使清除处于动态平衡，从而清除自由基对机体的危害，保护细胞免受损伤[23]，试验Ⅰ组中SOD活力最高，说明2％的小肽使机体清除氧自由基的功能上升，促进鱼体的正常生长。从以上分析可以得出，相对于鱼粉，小肽在提高鱼体免疫功能方面有较好的效果。本试验结果表明，2％~3%的小肽替代鱼粉一定程度上提高了异育银鲫的非特异性免疫力。
4 结论
本试验结果表明，2％～3％的小肽替代鱼粉能提高异育银鲫的消化酶活力和免疫能力，更重要的是能降低饲料成本，节约资源。
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摘 要 试验研究异育银鲫(Carassius auratus gibelio)饲料中小肽替代鱼粉对其内源酶(淀粉酶和蛋白酶)及血液指标的影响。以小肽制品(41%的棉粕肽)为肽源,分别添加0%、2%、3%、4%的小肽,配制成4组饲料。对平均重量为(16.0±0.2) g异育银鲫进行为期45 d的养殖试验。结果表明:2%的试验组淀粉酶、蛋白酶活力与对照组相比差异显著(P<0.05),但各试验组间的差异不显著(P>0.05);各组间血液指标差异不显著(P>0.05)。本试验表明异育银鲫饲料中小肽替代鱼粉的最佳替代水平为2%~3%。
关键词 小肽；淀粉酶；蛋白酶；血液指标
中图分类号 S965.117
张余霞，盐城工学院海洋技术系，224051，江苏盐城市迎宾大道9号。
王爱民(通讯作者)、韩光明、王煜恒、吴明林，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-09-14 |
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