刘襄河 孔江红 周 晔 王国霞 叶继丹
摘 要 采用离体消化法和茚三酮法研究了南美白对虾(Penaeus vannamei)的胃、肝胰脏及肠道粗酶液对鱼粉、豆粕、菜粕和花生粕的离体消化率和酶解动力学。结果表明：①在离体状态下，南美白对虾消化道不同部位对干物质消化率为：胃>肝胰脏>肠道，且鱼粉在胃部的消化率显著高于肝胰脏和肠道（P<0.01），花生粕在肠道的消化率极显著低于胃和肝胰脏（P<0.01）；对蛋白质消化率为肝胰脏>胃>肠道，且菜粕和花生粕在肠道的消化率极显著低于胃和肝胰脏。鱼粉差异显著（P<0.05）。②粗酶液对4种原料干物质的总消化率高低依次为：豆粕50.78％、菜粕42.02％、花生粕39％、鱼粉36.50％；对粗蛋白总消化率高低依次为：花生粕60.40％、豆粕56.45％、鱼粉46.28％、菜粕43.28％。③粗酶液对4种蛋白原料酶解时所产生氨基酸的生成量随着酶解时间的变化具有一定的线性关系；在0～4 h内在酶解过程中所产生氨基酸的总量为肝胰脏（96.72 mg）>胃（31.28 mg）>肠道（27.58 mg）；酶解时氨基酸生成总速度为花生粕（3.915 4 mg/h）>鱼粉（3.477 4 mg/h）>豆粕（2.831 6 mg/h）>菜粕（2.740 4 mg/h）。
关键词 南美白对虾；消化酶；离体消化率；酶解动力学
中图分类号 S963.16
离体消化法是在体外利用酶制剂或研究对象消化器官的酶提取液在试管内模拟试验动物的消化过程，对原料进行水解消化，其测定值近似反映对原料的消化率。与在体内消化率测定相比较，可以大大减少工作量，具有快速和简便的优点，是对饲料原料可利用性的评价方法之一[1-2]。本试验采用离体消化法，研究了从南美白对虾的胃、肝胰脏和肠道提取的粗酶液在离体条件下对4种常用蛋白原料的离体消化率和酶解动力学，旨在了解南美白对虾消化酶对饲料干物质、蛋白质的消化能力和消化酶分解蛋白质生成氨基酸的酶解过程及酶解能力，为南美白对虾配合饲料的研制和筛选最佳饲料配方提供一定的参考资料。
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
试验用南美白对虾购于当地水产品市场，共200尾，体长(10.0±0.5) cm，体重(8.0±0.2) g。对虾运回后暂养于室内水簇箱中备用，试验前24 h不投饲，以便于虾排出胃、肠道的内容物。
1.1.2 饲料原料
试验选用进口秘鲁鱼粉、豆粕、菜粕和花生粕共4种市售常规蛋白质饲料原料。所用的原料经植物粉碎机粉粹,全部通过80目标准筛,保存于-20 ℃冰箱备用。蛋白原料常规营养成分检测参照贺建华(2005)[3]饲料分析与检测,实测值见表1。
1.2 试验方法
1.2.1 粗酶液的制备
参照叶元土等(2003)[4]的方法稍改进。将活虾置于冰盘内玻璃平皿上，按照常规解剖取出对虾的胃、肠道和肝胰脏，再用预冷去离子纯水（4 ℃，pH值7.0）清洗胃、肠道内容物，用滤纸吸干表面水分后分别称取胃、肠道和肝胰脏的质量，并分别加入相当于其胃、肠、肝胰脏质量10倍体积（W/V）预冷0.2 mol/l的磷酸盐缓冲液（温度4 ℃，pH值7.4），用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆，并以5 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液作为粗酶液，冷冻保存于冰箱中备用。
1.2.2 离体消化率的测定
准确称量过80目筛的饲料样品各0.500 0 g，放入100 ml具塞锥形瓶中，加0.2 mol/l、pH值7.5的磷酸盐缓冲液47.5 ml（胃部酶粗提液的缓冲液pH值6.0）[5]，消化道各部位的粗酶液2.5 ml，并分别以消化道各部位的煮沸粗酶液为对照组。参照王子淑(1987)[6]的方法加入双抗(青霉素和硫酸链霉素)各150 IU/ml，间隔4 h补充1次。置于(37±1) ℃的恒温水浴振荡器中，以50 r/min进行离体酶解消化8 h。每个样品分别做3个平行试验，每个处理分别重复2次。
1.2.3 氨基酸生成量的测定
采用茚三酮法(1993)[7]测定酶解液中的氨基酸含量。具体操作如下：于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h分别取各试验组中的酶解液0.2 ml（同时补充等体积的磷酸缓冲液）,立即加入10％的三氯醋酸0.2 ml固定蛋白质,在6 000 r/min下离心20 min后取其上清液0.2 ml,加入pH值5.5、0.2 mol/l的醋酸缓冲液至2 ml,茚三酮试剂1 ml，于沸水中煮沸30 min，冷却至室温后，加入50%的乙醇7 ml，以不加样品的显色液为空白对照组，用分光光度计在570 nm测定吸光度值。用亮氨酸标准溶液作标准曲线进行对酶解液中的氨基酸进行定量分析。
1.3 消化率和氨基酸生成率测定的计算
粗酶液离体消化8 h后终止反应，对酶解残渣用定量滤纸过滤（滤纸预先烘干、称重），并用37 ℃的去离子纯水冲洗3~4次，取滤渣(含滤纸)在105 ℃下烘干并准确称重(蛋白原料也在105 ℃下烘干)。采用凯氏定氮法测定饲料原料及消化后滤渣的粗蛋白质含量。参照叶元土（2004）[2]、姜光明等（2009）[8]的方法计算蛋白原料的干物质、粗蛋白质的消化率，计算公式如下：
干物质消化率（%）＝（饲料样品重量－滤渣样品重量）/饲料样品重量×100；
蛋白质消化率（%）=（饲料样品重量×样品粗蛋白含量－滤渣样品重量×滤渣粗蛋白含量）/（饲料样品重量×样品粗蛋白含量）×100；
氨基酸生成率（%）=生成的氨基酸总量/饲料样品重量×100。
1.4 统计分析
采用SPSS13.0对数据进行统计分析，显著差异时进行One-Way ANOVA方差分析和LSD多重比较，数据采用平均值±标准差（Means±SD）表示。
2 结果与分析
2.1 南美白对虾消化道对4种蛋白原料的离体消化率
南美白对虾消化道不同部位提取的粗酶液对饲料原料干物质和粗蛋白的离体消化率结果见表2和表3。
由表2和表3可知，对虾不同消化部位提取的粗酶液对4种蛋白原料的体外消化率有差异，对干物质体外消化率以胃最高，其次为肝胰脏，肠道最低，且鱼粉在胃部的消化率极显著高于肝胰脏和肠道（P<0.01），花生粕在肠道的消化率极显著低于胃和肝胰脏(P<0.01)；而对蛋白质体外消化率是以肝胰脏最高,其次为胃,肠道最低,且菜粕和花生粕在肠道的消化率极显著低于胃和肝胰脏(P<0.01)，鱼粉差异显著(P<0.05)。
对于不同蛋白原料的干物质消化率为：胃对豆粕最大，鱼粉、花生粕次之，菜粕最小，但四者间差异不显著（P>0.05）；肝胰脏对豆粕最大，鱼粉最小，且豆粕和菜粕、花生粕的差异不显著（P>0.05）；肠道对豆粕最大，菜粕次之，鱼粉第3，花生粕最小，且四者间差异极显著（P<0.01）。
对于不同蛋白原料的蛋白质消化率为：胃对花生粕最大，豆粕次之，鱼粉第3，菜粕最小，花生粕极显著高于鱼粉、豆粕和菜粕（P<0.01），豆粕极显著高于菜粕（P<0.01）；肝胰脏对花生粕最大，豆粕次之，菜粕第3，鱼粉最小，四者之间差异显著（P<0.05）；肠道对豆粕最大，鱼粉次之，花生粕第3，菜粕最小，四者之间差异显著(P<0.05)，豆粕极显著高于菜粕和花生粕(P<0.01)，鱼粉显著高于菜粕和花生粕(P<0.05)。
对虾对4种饲料原料干物质的总消化率，即对虾胃、肝胰脏和肠道对各原料的干物质总消化率的平均值分别为：鱼粉为36.50％、豆粕为50.78％、菜粕为42.02％、花生粕为39％；对虾胃、肝胰脏和肠道对各原料的粗蛋白总消化率的平均值分别为:鱼粉为46.28％、豆粕为56.45％、菜粕为43.28％、花生粕为60.40％。
2.2 南美白对虾消化道对4种蛋白原料酶解氨基酸的生成速率及比较分析
0～4 h内对虾消化道各部位提取粗酶液酶解饲料原料所生成的氨基酸量(mg)随时间(h)的变化关系见表4。由表4可知：①对虾胃、肝胰脏及肠道粗酶液对4种蛋白原料进行酶解的0～4 h内所产生氨基酸的生成量随着酶解时间的变化而具有一定的线性关系。②在0～4 h内对虾胃粗酶液对4种饲料原料蛋白质酶解生成氨基酸总量分别为鱼粉6.45 mg、豆粕6.62 mg、菜粕6.64 mg、花生粕11.57 mg；肝胰脏分别为鱼粉22.41 mg、豆粕23.40 mg、菜粕21.15 mg、花生粕29.77 mg;肠道分别为鱼粉12.88 mg、豆粕3.96 mg、菜粕5.10 mg、花生粕5.64 mg。在酶解过程中所产生氨基酸的总量为肝胰脏>胃>肠道。③鱼粉、豆粕、菜粕和花生粕在酶解过程中氨基酸生成总速度(对虾胃、肝胰脏及肠道对各饲料蛋白质酶解生成氨基酸的总速度)分别为:鱼粉3.477 4 mg/h、豆粕2.831 6 mg/h、菜粕2.740 4 mg/h、花生粕3.9154 mg/h。4种蛋白原料酶解时氨基酸的生成总速率为花生粕>鱼粉>豆粕>菜粕。
3 讨论
3.1 蛋白原料的离体消化率及酶解速度的影响因素
不同的蛋白原料的物质结构、化学组成和性质有差异,使其蛋白质品质即氨基酸的组成存在差异,导致了其蛋白质被酶解的速度和程度有所不同。Savose(1989)[9]、施用辉等(2001)[10]、王丽娟等(2004)[11]、向枭等(2006)[12]证实了不同蛋白质原料被酶解的速度有一定差异，本试验结果与其一致。植物性蛋白原料，如豆粕、菜粕和花生粕等存在的多种抗营养因子会影响原料的消化率。豆粕、棉粕、菜粕膨化后，降低棉抗营养因子的含量，岩原鲤(Procypris rabaudi Tchang)对其干物质、蛋白质的离体消化率以及酶解氨基酸的生成速度均显著增加[13]；异育银鲫(Carassius auratus gibelio)对膨化后的玉米、菜粕和次粉的酶解生成氨基酸的量显著提高[14]。
蛋白质在消化道内被消化酶水解为氨基酸、小肽后被转运和吸收，需经过多步水解反应以及多种消化酶的催化作用才能实现。消化酶种类决定了酶解位点的数量和对蛋白质肽链的水解程度，而酶活力的高低决定了对饲料蛋白质水解能力的大小。草食性鱼类对蛋白质的消化和吸收主要由肠道来完成，肝胰脏所起的消化作用较小；肉食性鱼类在蛋白质的消化中肝胰脏的作用较大，可能与肉食性鱼类大多数属于有胃鱼有关[15]。草鱼(Ctenopharyngodon idella)由于缺少胃蛋白酶,蛋白消化主要在前肠和中肠,而肝胰脏相对较小[4]；岩原鲤肠道酶液对蛋白质离体消化率大于肝胰脏酶液[13]；齐口裂腹鱼(schizothorax prenanti)肠道离体消化率高于肝胰脏[16]；鲇(Silurus asotus Linnaeus)和兰州鲇(S ilurus lanzhouensis)的消化和酶解主要在前肠和中肠[12，17]；铜鱼(Coreius heterodon)体外消化能力为：中肠>肝胰脏>前肠>后肠[18]；大眼鳜(Siniperca kneri)和斑点叉尾■(Ictalurus punctatus)的肝胰脏的酶解能力比肠道高[15]。本试验中，南美白对虾消化和酶解主要部位是肝胰脏和胃，这与其食性相一致。
3.2 南美白对虾消化道粗酶液对饲料原料的离体消化能力分析
饲料原料蛋白质在鱼虾消化道中被消化的程度取决于消化酶（蛋白质主要是蛋白酶）的作用时间，消化酶解速度受消化酶的浓度、温度、底物和作用时间的影响[19]。本试验中对虾消化道各部分粗酶液对原料粗蛋白的消化能力为肝胰脏>胃>肠；对虾对原料干物质消化率为胃>肝胰脏>肠。对虾胃和肝胰脏对豆粕和花生粕的干物质的消化率高于鱼粉，对蛋白质的消化率豆粕和花生粕高于鱼粉，说明豆粕和花生粕部分替代鱼粉，可以满足对虾对饲料蛋白质的需求。白燕等（2006）[20]用鲫鱼（Carassius auratus）肠道酶液对4种蛋白质饲料的离体消化率以花生粕为最高，且花生粕的氨基酸生成效率较高，也证明在保证氨基酸平衡的前提下，可以用花生粕部分替代鱼粉。
鱼虾消化道不同部位对饲料原料的消化率与各部分酶活性的大小有关，其消化酶活性越高，对饲料的消化能力就越强。本试验中测得的对虾消化道各部分粗酶液对蛋白原料消化率的高低与南美白对虾消化酶的活性研究的结果相一致[5]。
3.3 南美白对虾消化道粗酶液对蛋白原料的酶解能力分析
鱼类从外界环境中摄取饲料蛋白质后，经过动物机体消化酶的作用分解为小肽（二肽、三肽）、氨基酸被有效地吸收利用，且小肽在总体氨基酸的吸收中占有重要地位[10]。蛋白质酶解成氨基酸后才被动物吸收利用，易于酶解的蛋白质易于被动物充分利用，优质蛋白质更易酶解产生氨基酸，故消化率更高。酶解蛋白质时生成氨基酸速率的高低反映了饲料蛋白质的性质和质量，可作为蛋白质营养价值的评定指标之一。鱼类消化道对蛋白质消化的终产物是以小肽为主还是以氨基酸为主，其种类、数量和比例，仍然需要进行系统、深入的研究。鱼类对蛋白质原料的消化主要靠鱼体内消化道中所分泌的各种蛋白酶的作用来完成，胃部分泌的蛋白酶主要是把蛋白质降解成多肽、小肽和少量的氨基酸，而大量的氨基酸和小肽的生成由肝胰脏和肠道的蛋白酶协同作用完成。
本试验中，酶解过程中所产生氨基酸的总量为肝胰脏>胃>肠道，说明南美白对虾对蛋白原料的消化和酶解主要集中在肝胰脏；氨基酸的生成总速率为花生粕>鱼粉>豆粕>菜粕，且花生粕氨基酸生成量高于鱼粉，豆粕与鱼粉的较接近，说明南美白对虾对花生粕和豆粕有较好的利用能力。在南美白对虾配合饲料的开发过程中，可以适量用花生粕和豆粕等植物蛋白替代动物蛋白，减少鱼粉等动物蛋白质原料的用量，既有利于降低饲料成本，又能降低对水域环境的污染。
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（编辑：沈桂宇，）
刘襄河，集美大学水产学院，361021，福建省厦门市集美区印斗路43号。
孔江红、叶继丹(通讯作者)，单位及通讯地址同第一作者。
周晔、王国霞，珠海市农业科学研究中心。
收稿日期：2009-10-26
★ 厦门市科技重点项目（3502Z20093024） |
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