张美红 胡重江 李英文
胰蛋白酶（trypsin）是消化酶的一种，属于丝氨酸蛋白酶家族。胰蛋白酶是一种肽链内切酶，对由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其它氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外，还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键 > 酰胺键 > 肽键。
胰蛋白酶来源于鱼类的肝胰脏、肠道和幽门盲囊。许多研究报道，胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于鱼类胰脏中，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。本文围绕鱼类胰蛋白酶在分离纯化、特性、氨基酸组成以及序列分析等方面进行探讨，对其在国内外的研究作一个概括性的总结，为进一步研究鱼类胰蛋白酶提供参考。
1 鱼类胰蛋白酶的分离纯化研究
从许多哺乳动物中都已经分离出了胰蛋白酶以及胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶，如鼠、狗、牛、猪及人类。有关鱼类消化酶的研究也有大量的报道，关于鱼类胰蛋白酶的研究，国外要比国内开展得早而且多。迄今为止，已研究报道了鲤鱼（Cohen等 1981）、沙丁鱼(Murakami和Noda 1981)、柳叶鱼（Hjelmeland和Raa 1982）、鲶鱼(Yoshinaka等 1983)、格陵兰鳕(Simpson和Haard 1984)、角鲨（Ramakrishna等 1987）、凤尾鱼（Martinez等 1988）、大西洋鳕（Bjarni等 1989）、虹鳟（Kristjansson 1991）、大西洋鲑（Outzen 1996）、红点石斑鱼(Diaz 1999)、马苏大麻哈鱼（Sekizaki 2000）、笛鲷（Mishelle Rivera Santos 2003）等胰蛋白酶的纯化。截至2004年，国内外已对软骨鱼的4种、硬骨鱼的27种的胰蛋白酶进行了分离纯化工作，但其中只有两种淡水鱼（鲤鱼、欧洲鲫鱼）。
胰蛋白酶的分离纯化，一般都遵循蛋白质等生物大分子的原则。主要是利用它们之间特异性的差异进行分离，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其它分子的亲和性等。常用的分离纯化方法有沉淀法、离心、透析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等等。早期纯化是用盐析、离心等简单的分离方式；后期纯化都偏向于用层析法，其中较为经典的方法为亲和层析法。亲和层析一般采用胰蛋白酶抑制剂作为亲和配体，如苯甲脒（凤尾鱼，Martinez等 1988）、卵类粘蛋白（角鲨，Koiti Titani 1975）、大豆胰蛋白酶抑制剂（鲻鱼，Guizani 1991）等。主要采用的载体为Sapharose-4B。离子交换层析一般是进行阴离子交换，因为鱼类胰蛋白酶在中性及碱性溶液通常以阴离子形式存在。凝胶过滤层析是用来除去胰蛋白酶中的盐等小分子物质。
2 鱼类胰蛋白酶的特性研究
在国内，黄峰等（1996）研究了鲢、鳙消化器官组织中胰蛋白酶活性的分布；阮国良等（2004）对月鳢消化系统不同部位胰蛋白酶的最适pH值进行了研究；杨代勤等（2003）研究了不同饲料对黄鳝胰蛋白酶活性的影响。
在国外，有关胰蛋白酶的研究更加多且深入。Jany（1976）报道了鲫的一些组织器官中的胰蛋白酶；Yoshinaka等（1984）研究了日本鳗鲡的胰蛋白酶活性的分布；Uys和Hecht（1987）分析了胡子鲶的胰蛋白酶；Segner等（1989）用酶组织化学方法观察了白鲑消化道胰蛋白酶的分布；Bitterlich（1985）研究了鲢、鳙10等分肠段内粗制胰蛋白酶的活性。
2.1 胰蛋白酶最适pH值的研究
国内关于胰蛋白酶最适pH值的研究资料较少。根据国内外学者所研究过的14种鱼类的结果显示，鱼类胰蛋白酶适宜pH值一般在7.0～9.0。阮国良等（2004）测出月鳢胃粘膜组织、前肠粘膜组织和肝胰脏的胰蛋白酶的适宜pH值分别为7.4、7.4和7.0；黄峰等（1996）根据实验得出鲢、鳙胰蛋白酶适宜pH值均为8.3，大口鲶(1983)为9.0，而虹鳟（1991）、鲑鱼（1996）则大于9.0(分别为9.5和10.6)；与此同时，同属不同种的鱼类的胰蛋白酶活性的适宜pH值有时也存在明显差异。综合上述研究结果可知，大多数鱼类消化道中的胰蛋白酶活性适宜pH值都是中性偏碱性，在酸性条件下极不稳定，同时也存在种属特异性。
2.2 胰蛋白酶最适温度的研究
据研究报道，鱼类胰蛋白酶的最适反应温度在30～60℃范围内。这与消化酶适宜的温度范围相一致。如非洲鲶鱼（Uys和Hecht 1987）、红点石斑鱼（1999）胰蛋白酶的最适温度为30～40℃，虹鳟（1991）为40～50℃，鲻鱼（1991）为55℃，笛鲷（2003）的胰蛋白酶可高达60℃。但胰蛋白酶稳定的温度范围与其最适反应的温度相差很大，如凤尾鱼（M.S.Heu等 1995）胰蛋白酶在45℃保温30min，失去20%的活性；在55℃时失去60%的活性；在60℃时则全部失去活性。
2.3 底物浓度影响胰蛋白酶水解速度的研究
底物浓度对胰蛋白酶水解速度的影响可用米氏常数（Km）来表示。米氏常数即为反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。它是酶的特征性常数，Km值越小，酶与底物的亲和力越大。大西洋鳕（Bjarni等 1989）的胰蛋白酶用对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（tosyl-L-arginine-methyl ester，简称TAME）作底物时，其Km值为29μM；以N-苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide，简称BAPA或BAPNA）为底物时，Km值为77μM，其中以BAPA为底物所测得的Km值比同样条件下测得的牛胰蛋白酶的Km值小8倍。结果表明，大西洋鳕胰蛋白酶与BAPA的亲和力要比TAME的亲和力小。N.Guizani等（1991）也做了类似的研究，发现鲻鱼胰蛋白酶对TAME的亲和力也比BAPA要大些。这充分证明了胰蛋白酶对酯键催化水解活性的敏感度要大于对酰胺键催化水解活性的敏感度。
2.4 抑制剂影响胰蛋白酶活力的研究
胰蛋白酶的抑制剂是一种能够降低胰蛋白酶活性的小分子物质，可分为3类：蛋白抑制剂、竞争性抑制剂和活性中心滴定剂。以大西洋鳕（Bjarni等 1989）为例，其胰蛋白酶以BAPA为底物，在25℃添加不同浓度的竞争性抑制剂保温30min，测其剩余活性。结果显示，加入50mM 乙二醇双（2－氨乙基)四乙酸 (EGTA)，胰蛋白酶剩余活性还有17%；加入1mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），其剩余活性还有11％；加入20μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂，其剩余活性还有9%，而加入0.2mg/μl的大豆胰蛋白酶抑制剂，其剩余活性为91％；加入0.5mg/ml卵类粘蛋白或者5mM的苯甲脒可以完全抑制其活性。这表明了不同抑制剂的不同浓度对胰蛋白酶活性的抑制程度是不同的。
2.5 胰蛋白酶分子量的研究
鱼类胰蛋白酶的分子量一般是通过SDS－PAGE凝胶电泳来进行测定的。1971年，Keil曾报道胰蛋白酶的分子量为20 000～24 000。但是从很多鱼类分离出的胰蛋白酶的分子量都在这个范围之外。Martinez等（1988）测得凤尾鱼的胰蛋白酶的分子量为25 600；Outzen等（1996）得出大西洋鲑的胰蛋白酶分子量为25 000、笛鲷（2003）为26 100；鲤鱼（Min-Jie CAO等 2000）则为28 000。据目前研究，鱼类胰蛋白酶的分子量主要范围是在18 000～28 000。
2.6 胰蛋白酶等电点的研究
总结几十年来许多学者的研究报道，鱼类胰蛋白酶的等电点一般在4.5～6.0范围内。所以，在中性条件下，绝大部分胰蛋白酶都属于碱性蛋白酶，只有个别鱼类胰蛋白酶为酸性。如Outzen等(1996)从大西洋鲑中纯化得出的4种带电不同的胰蛋白酶，其中3种属于碱性胰蛋白酶，而另外一种属于酸性胰蛋白酶，这是首次从鱼类中分离纯化出了酸性胰蛋白酶。这与哺乳动物相比有很大的差异，哺乳动物的胰蛋白酶的等电点一般为8.0～9.0，因此，哺乳动物类胰蛋白酶都属于酸性蛋白酶。
3 胰蛋白酶的氨基酸组成与序列分析
牛、猪、鼠胰蛋白酶的氨基酸序列表现出广泛的同源性，都由223个氨基酸残基组成。鱼类胰蛋白酶的氨基酸组成与哺乳动物的氨基酸组成也很相似。Titani等（1975）测出角鲨的胰蛋白酶比牛和猪的胰蛋白酶只少一个氨基酸；Yoshinaka等（1984）得出鲶鱼胰蛋白酶的氨基酸组成与牛胰蛋白酶相似的结论；Beirao（2001）研究了鳕胰蛋白酶的氨基酸组成，也得出了同样的结论。
据目前鱼类胰蛋白酶的序列研究报道显示，日本凤尾鱼（Ahsan MN等 2001）、大西洋鲑（Male R等 1995）、大马哈鱼（Toyota E等 2002）和日本比目鱼（Tohru Suzuki等 2002）的胰蛋白酶存在有多条cDNA，数量分别为2、5、4、3。Tohru Suzuki等（2002）将日本比目鱼与其它硬骨鱼及哺乳动物的胰蛋白酶基因进行系统进化分析，得知胰蛋白酶的倍增早于有鳍鱼类的分化。Min-Jie CAO等（2000）测出鲤鱼两种胰蛋白酶的N-末端序列，发现它与狗、鼠、猪、牛、角鲨和大西洋鳕的氨基端序列非常相似。
总之，胰蛋白酶是广泛应用于轻工业、医药工业、食品加工业、畜牧业和现代生物技术领域的一种非常重要的酶。据统计，在众多蛋白质水解酶中，胰蛋白酶的年消耗量就占了酶制品市场的3％左右。对胰蛋白酶的纯化及其特性的研究，不仅有助于了解胰蛋白酶结构与功能的关系，而且有助于探究鱼类的营养生理特点，为人工饵料的设计提供理论依据。较高活性胰蛋白酶的提取利用，还有利于水产品加工过程中充分利用废弃物。但是到目前为止，鱼类胰蛋白酶的研究在国内还处于刚刚起步的阶段，迫切需要对胰蛋白酶的基础理论进行更加深入透彻的研究，使该研究领域赶超世界先进水平。
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（编辑：张学智，）
张美红，西南大学水产与水文学院，400716，重庆北碚，水产与水文学院640#。
胡重江，单位及通讯地址同第一作者。
李英文，重庆师范大学生命科学学院。
收稿日期：2005-10-19 |
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