马歌丽 高建奇 张志刚 何万亮
摘 要 从实验室保藏菌种中筛选得到一株产脂肪酶能力较强的根霉菌种MHL4.07，对MHL4.07菌摇瓶发酵产酶培养基组成进行了试验，结果表明，种子培养时间为84 h，最佳发酵培养基（g/l）：玉米浆40.0、橄榄油12.5、豆饼粉20.0、NH4Cl 20.0、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO4 1.0、KCl 0.5。用最佳培养基发酵产生的脂肪酶活力为41.91 U/ml，该产量比初始菌株的酶活提高了408％。
关键词 脂肪酶；根霉；筛选；培养基
中图分类号 Q814
Isolation of rhizopus arrhizus producing lipase and studying of fermentating culture medium
Ma Geli, Gao Jianqi, Zhang Zhigang, He Wanliang
Abstract A lipase-producing rhizopus arrhizus MHL4.07 was obtained by screening of microorganisms stored in our lab .Under laboratorial conditions, the culture medium of lipase produced by MHL4.07 was studied. The results showed that: The culture time of seed was 84 h.The compositions of optimal fermentation medium（g/l） were: corn steep liquor 40.0, olive oil 12.5, bean cake flour 20.0, NH4Cl 20.0, MgSO4·7H2O 0.5, K2HPO4 1.0, KCl 0.5. Under the optimum conditions the maximum yield of lipase was 41.91 U/ml and it was increased 408%.
key words lipase；rhizopus arrhizus；isolation；culture medium
脂肪酶(lipase,EC3.1.1.3,甘油酯水解酶) 是可以催化酯类化合物分解、合成和酯交换的酶，它具有化学选择性和立体异构专一性，反应不需要辅酶，反应条件温和，副产物少，被广泛应用于食品、轻纺、皮革、精细化工、有机合成、医药等领域[1]。
脂肪酶的来源有2种：一种是从动植物组织中提取；另一种由微生物发酵法生产。因为微生物脂肪酶种类多，具有比动植物脂肪酶更广泛的pH值和温度作用范围，适合工业化生产，所以微生物发酵法生产成为得到脂肪酶的重要技术手段。目前报道的用于产生脂肪酶的微生物主要有无根根霉(Rhizopus arrhizus)[2]、扩展青霉(Penicillium expansum)[3]、假丝酵母(Candida rugosa)[4]、假单孢菌(Pseudomonas sp.)[5]等，其中从根霉菌中已分离到30多种脂肪酶，且有多种根霉脂肪酶已被制成商品化酶制剂[6]。笔者从实验室保藏的菌种中筛选到一株产脂肪酶能力较强的无根根霉菌株，并对其发酵产酶培养基组成条件进行了研究。
1 材料与方法
1.1 菌种
根霉(Rhizopus arrhizus)为生物工程实验室保藏菌种。
1.2 培养基
斜面培养基：NaNO3 2.0 g/l、K2HPO4 1.0 g/l、KCl 0.5 g/l、MgSO4·7H2O 0.5 g/l、FeSO4·7H2O 0.01 g/l、蔗糖30 g/l、琼脂17.5 g/l，pH值6.5。
初筛培养基：NaNO3 3.0 g/l、K2HPO4 1.0 g/l、KCl 0.5 g/l、MgSO4·7H2O 0.5 g/l、FeSO4·7H2O 0.01 g/l、蔗糖30 g/l、琼脂15～20 g/l、橄榄油30 g/l，自然pH值。
种子培养基：谷氨酸钠0.5 g/l、KH2PO4 1.0 g/l、KCl 0.1 g/l、葡萄糖10.0 g/l，自然pH值。
初始发酵培养基：玉米浆30.0 g/l、尿素6.0 g/l、K2HPO4 1.0 g/l、KCl 0.5 g/l、MgSO4 0.5 g/l、橄榄油10.0 g/l，自然pH值。
1.3 培养方法
1.3.1 初筛
采用稀释平板分离法进行初筛。过程为：分别移取不同稀释度的菌悬液涂于初筛培养基平板上，于28 ℃恒温培养箱中培养48 h，根据透明圈直径和菌落直径比值大小筛选菌株，选透明圈直径大的菌株用于复筛。
1.3.2 复筛
挑取斜面孢子接种到种子培养基中，于28 ℃、160 r/min摇床培养24 h，再将种子液按2%接种量接种到发酵培养基中(250 ml三角瓶中发酵液装液量为50 ml)，经28 ℃、160 r/min发酵培养72 h，将发酵液离心，测定上清液的脂肪酶酶活，确定高产菌株。
1.4 分析方法
1.4.1 脂肪酶酶活测定与计算
采用橄榄油乳化法测定脂肪酶酶活[7]。
1.4.1.1 酶活定义
以每分钟催化底物产生1 μmol游离脂肪酸所需要的脂肪酶量定义为一个脂肪酶酶活单位(U)。
1.4.1.2 酶活测定
在试管中加入5 ml橄榄油乳化液和4 ml缓冲液，于40 ℃恒温水浴振荡器中预热5 min，然后加入1 ml酶液，保温反应10 min后立即加入15 ml 95％乙醇终止反应，再加入15 ml水进行稀释，用经标定的0.05 mol/l NaOH溶液滴定水解产生的游离脂肪酸，用pH电极指示滴定终点，记录消耗的NaOH体积。同时做空白实验，即在预热后先加入95％乙醇终止剂再加入酶液，其它操作同测试液。
1.4.1.3 酶活计算
式中：V——滴定样液所消耗的NaOH溶液体积（ml）；V0——滴定空白样所消耗的NaOH溶液体积（ml）；
t——反应时间(min)；
n——酶液体积（ml）；
M——滴定用的NaOH溶液的浓度（mmol/l） 。
1.4.2 生物量测定
比浊法测定生物量[8]。将活化后的斜面菌株接入种子培养基中，于28 ℃、160 r/min摇床培养，每隔一定时间取样，用721型分光光度计在600 nm下测其OD值。
2 结果与讨论
2.1 脂肪酶产生菌的筛选
2.1.1 菌种初筛
对实验室保藏的根霉菌进行稀释分离和平板筛选，共得到52株菌株，从中挑选得到透明圈直径与菌落直径比值大的9个菌落，其菌落特征见表1。
由表1可以看出，筛选出的9个菌落均符合统一筛选标准，即菌落表面没有杂色，菌落透明圈相对较大，透明圈边沿整洁，菌落柔滑细腻、边缘整洁。但这些菌落直径并不相同，透明圈的大小更是相差较大，初步估计这些菌株产生脂肪酶的能力有所不同。
2.1.2 菌种复筛
对筛选出的9株根霉菌株进行纯培养，接种到种子培养基中，于28 ℃、160 r/min摇床培养72 h，测定发酵液的酶活，结果如表2所示。
由表2可知，MHL4.07菌的初始脂肪酶酶活最高，达到8.25 U/ml；MHL4.03菌和MHL4.04菌具有相同的酶活，但都比MHL4.07菌的产酶活力低。因此，确定MHL4.07菌株为以后进行的摇瓶发酵培养基组成研究的出发菌株。
对比表1和表2发现，菌落透明圈直径与菌落直径比值大小与菌株产生脂肪酶能力之间的相关关系不明显，分析原因可能是：①试验菌株数太少，相关关系没有反映出来；②透明圈边缘不明显，造成测量误差。故使用透明圈法初筛脂肪酶产生菌株的理论依据需要进一步通过试验验证。
2.1.3 生长曲线的绘制
将MHL 4.07菌活化培养24 h，挑取两环，接种于种子培养基中，于28 ℃、160 r/min摇床培养，定时取样测定其生物量（OD600）， 结果如图1所示。
由图1可见，MHL4.07菌的生长可分为4个阶段：0～42 h为生长延迟期；42～96 h为对数生长期；96～120 h为生长稳定期；120～168 h为生长衰亡期。由于在对数生长期，细胞平衡生长，菌体内各种成分均匀，整个群体的生理特性较一致，细胞中的成分平衡发展和生长速率恒定，比较适宜作为代谢、生理等研究的材料[8]；适宜的接种时间应选择在对数生长后期，因此确定MHL4.07菌的种子培养时间为84 h左右。
2.2 发酵培养基组成研究
2.2.1 碳源种类对MHL4.07菌产脂肪酶的影响
分别用表3中的碳源代替初始发酵培养基中的碳源，配制不同的发酵培养基。把培养84 h的MHL4.07菌种按2%接种量接种到新配制的发酵培养基中，在28 ℃、160 r/min培养72 h，测定发酵液的酶活，结果如图2所示。
由图2可以看出，以玉米浆30 g/l＋橄榄油10 g/l为复合碳源时，发酵产脂肪酶的酶活最高，达到8.372 U/ml，其次为以葡萄糖20 g/l为碳源的，但两者的酶活相差很大，说明菌株MHL4.07对于不同碳源的利用率不同。试验确定玉米浆30 g/l＋橄榄油10 g/l为发酵培养基复合碳源。
2.2.2 碳源用量对MHL4.07菌产脂肪酶的影响
2.2.2.1 玉米浆用量对产脂肪酶酶活的影响
橄榄油用量为10 g/l，改变玉米浆用量，在28 ℃、160 r/min摇瓶发酵培养72 h，测定MHL4.07菌发酵液酶活，结果如图3所示。
由图3可以看出，在添加橄榄油的基础上，MHL4.07菌产脂肪酶酶活随玉米浆用量的增加而增大，当玉米浆用量为40 g/l时，发酵液中脂肪酶酶活达到最大值，为12.80 U/ml。因此，确定玉米浆的最佳用量为40 g/l。
2.2.2.2 橄榄油用量对产脂肪酶酶活的影响
保持玉米浆用量40 g/l不变，改变橄榄油的用量，在28 ℃、160 r/min发酶培养72 h，探索橄榄油用量对MHL4.07菌发酵产脂肪酶酶活的影响，结果如图4所示。
由图4可知，随着橄榄油用量的增加，MHL4.07菌发酵液的酶活逐渐增大,当橄榄油用量增加到10 g/l时，MHL4.07菌产脂肪酶酶活有一个明显跳跃；在橄榄油用量为12.5 g/l时，MHL4.07菌产脂肪酶酶活最大，为21.37 U/ml；而后随着橄榄油用量的增加酶活稍有下降，但是下降趋势并不明显，即橄榄油用量对脂肪酶酶活的抑制作用并不明显。因此，确定橄榄油的最佳用量为12.5 g/l。
2.2.3 氮源种类对MHL4.07菌产脂肪酶的影响
以橄榄油12.5 g/l＋玉米浆40 g/l为碳源，按表4所示的氮源代替原始发酵培养基中的氮源，在28 ℃、160 r/min发酵培养72 h，测定MHL4.07菌发酵液酶活，结果如图5所示。
由图5可知，一般情况下复合氮源的酶活比单一氮源的酶活高，最佳氮源为豆饼粉30 g/l＋NH4Cl 20 g/l。
2.2.4 氮源用量对MHL4.07菌产脂肪酶的影响
2.2.4.1 豆饼粉用量对MHL4.07菌产脂肪酶酶活的影响
保持NH4Cl用量20 g/l不变，改变豆饼粉用量，在28 ℃、160 r/min发酶培养72 h，测定豆饼粉用量对产脂肪酶酶活的影响，结果如图6所示。
由图6可以看出，随着豆饼粉用量的增加，发酵液酶活呈现先升后降的趋势，在豆饼粉用量为20 g/l时，发酵液酶活最大，为41.26 U/ml。由此分析，豆饼粉用量达到提供足够氮源的最大量时，再增加其用量则对酶的产生有一定抑制作用，故确定豆饼粉最佳用量为20 g/l。
2.2.4.2 NH4Cl用量对产脂肪酶酶活的影响
保持豆饼粉用量20 g/l不变， 改变NH4Cl用量，在28 ℃、160 r/min发酵培养72 h，测定NH4Cl用量对MHL4.07菌发酵产脂肪酶酶活的影响，结果如图7所示。
由图7可以看出：随着NH4Cl添加量的增加，MHL4.07菌发酵产脂肪酶酶活也呈现先升后降的趋势，NH4Cl用量为20 g/l时，发酵液的脂肪酶酶活最高，达41.91 U/ml。因此，确定最佳NH4Cl用量为20 g/l。
3 结论
通过对实验室保藏菌株的筛选，得到一株产脂肪酶活力较高的根霉MHL4.07菌，其初始酶活为8.25 U/ml；通过对MHL4.07菌生长曲线测定，得到最佳种子培养时间为84 h。通过对MHL4.07菌摇瓶发酵产酶培养基组成的研究，得到最佳发酵培养基组成为（g/l）：玉米浆40.0、橄榄油12.5、豆饼粉20.0、NH4Cl 20.0、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO4 1.0、KCl 0.5。用最佳发酵培养基(250 ml三角瓶中装液量为50 ml)接种量为2%，28 ℃、160 r/min摇床培养72 h，MHL4.07菌最大产酶活力达41.91 U/ml，比初始菌株的酶活提高了408％。
该研究结果对根霉菌发酵生产脂肪酶提供了高产脂肪菌株，也为进一步探索培养条件对MHL4.07菌发酵产脂肪酶的影响奠定了基础，对于微生物生产脂肪酶的实验研究有一定指导意义。
参考文献
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8 岑沛霖，蔡谨.工业微生物[M].北京：化学工业出版社，2003.87～134
（编辑：高 雁，）
马歌丽，郑州轻工业学院食品与生物工程学院，副教授，450002，郑州市东风路5号。
高建奇、张志刚、何万亮，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2006-08-31
★ 河南省科技厅科技攻关项目资助（编号0324230007） |
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