刘 珍 王卫国
摘 要 选用胰蛋白酶水解谷朊粉，用甲醛滴定法测定其水解度。在对温度、时间、pH值、底物浓度（固液比）和酶浓度(酶与底物的比值) 等单因素试验的基础上做4因素3水平正交试验。试验结果表明：胰蛋白酶水解谷朊粉的最佳条件为温度40 ℃、时间4 h、pH值8.5、底物浓度（固液比）1.5%、酶浓度8％(酶与底物的比值)，得到的水解度为15.34％。
关键词 谷朊粉；胰蛋白酶；水解
中图分类号 Q946.5
因谷朊粉销路不好而限制了企业的生产和经济效益，也直接导致小麦利用程度降低，生产谷朊粉水解蛋白饲料可为这些企业提供谷朊粉利用的新技术和新市场。谷朊粉又称小麦面筋蛋白，是将小麦面粉中的蛋白质分离、提取并烘干而制成的一种粉末状产品，主要由麦溶蛋白和麦谷蛋白组成。谷朊粉一个显著的特点就是含有较多的谷氨酸(多以酰胺形式存在，约1/3)和脯氨酸(约1/7)，谷氨酰胺具有重要的生理活性功能。国外的最新研究表明，用酶解等生化处理谷朊粉制得水解蛋白饲料对仔猪有很高的消化率，无抗营养因子，可促进仔猪肠道绒毛的发育，获得较高的饲料转化效率，可替代昂贵的喷雾干燥血浆蛋白(2.5%～8%)。国内有关酶解脱脂大豆、棉粕的研究较多,而酶解谷朊粉方面的报道较少。本文研究用胰蛋白酶来水解谷朊粉生产小肽液的最佳工艺条件。
1 材料与方法
1.1 试验材料
谷朊粉购自河南莲花味精集团，粗蛋白含量80.3％；胰蛋白酶购自宝信生物有限公司。
1.2 试验试剂与设备
SHZ-82XIN型水浴恒温振荡器，江苏太仓医疗器械厂；PHS-25型酸度计，上海伟业仪器厂。
1.3 酶活力的测定
采取蛋白酶活的典型测定方法——Folin-酚试剂法。
1.4 水解度测定方法
①甲醛滴定法测水解液中氨态氮；②水解度计算公式按赵新准等《大豆蛋白水解物水解度的测定研究》方法进行。
1.5 酶解法试验步骤
取一定量的谷朊粉溶于100 ml的缓冲溶液中，在适宜的温度下，加热10 min，冷却至酶的最适温度下保温10 min；加酶，在恒温震荡器上震荡一定时间，然后在沸水中放置10 min灭活酶。灭活后移取50ml水解液于离心管离心10 min（3 000 r/min，），取上清液进行指标的测定。
2 结果与讨论
2.1 谷朊粉在不同pH值下的溶解度
从图1可以看出，谷朊粉在pH值4～8时溶解度最小，而pH值小于4或pH值大于8时有加速谷朊粉溶解的作用。小麦蛋白是一种络合蛋白，没有明显的等电点。麦谷蛋白不溶于水，麦醇溶蛋白在pH值6～9时溶解度最低，而酸或碱能加速醇溶蛋白的溶解。
2.2 酶活的测定
测得试验所用的胰蛋白酶酶活为4.0×103 U/g。
2.3 样品前处理
小麦蛋白含有麦醇溶蛋白、麦谷蛋白及麦清蛋白等组分。麦谷蛋白除了分子内二硫键外，有许多亚基通过分子间二硫键形成纤维网状大分子结构。这种网状结构使大部分亚基很难与酶充分接触。另外，维持蛋白质三维结构的除了肽键和二硫键外还有氢键、疏水键和范德华力这些次级键的作用，它们单独存在作用比较弱，但各种次级键加起来，就足以维持蛋白质空间结构的强大作用力。因此，第一个肽键的断裂就成了酶水解的限速步骤，适当的预处理能使部分基团暴露，取消限速步骤，使酶解加速进行。本试验用热处理方法对谷朊粉进行预处理。预处理温度和时间对水解度的影响见图2、图3。预热10 min时水解度最高，以后随时间延长水解度逐渐下降；在68 ℃时水解度最高，以后随着温度升高水解度急剧下降。
2.4 影响胰蛋白酶水解谷朊粉因素
2.4.1 pH值对胰蛋白酶水解度影响
在底物浓度为1.5%、酶浓度为5%、温度为40 ℃、反应时间为3 h的条件下，考查不同pH值对胰蛋白酶水解度的影响(见图4)。由图4可知，pH值在8.5前水解度迅速上升，pH值为8.5左右时水解度最高5.88%，以后开始下降。
2.4.2 温度对胰蛋白酶水解度的影响
在pH值为8.5、底物浓度为1.5%、酶浓度为5%、反应时间为3 h的条件下，考查不同温度对胰蛋白酶水解度的影响（见图5）。由图5可知，温度在40 ℃之前，水解度迅速上升，温度40 ℃时水解度最高，为7.15%，以后水解度迅速下降。
2.4.3底物浓度对胰蛋白酶水解度的影响
在pH值为8.5、酶浓度为5%、温度为40 ℃、反应时间为3 h的条件下，考查底物浓度对水解度的影响(见图6)。从图6可知，在底物浓度为0.5%时水解度较高(4.65%)；底物浓度在0.5%～1%之间水解度快速下降；底物浓度为1%～1.5％时又缓慢增高；大于1.5％后水解度开始缓慢降低。
由图7可知，当pH值为8.5、底物浓度为1.5%、温度为40 ℃、酶浓度为5%时，随着反应的进行，水解度迅速提高，反应4 h时，水解度增加变缓，反应5 h时水解度最高，为10.57%。
2.4.5 酶浓度对水解度的影响(见图8)
由图8可知，当pH值为8.5、底物浓度为1.5%、温度为40 ℃、反应时间为3 h的条件下，随着酶浓度的提高，水解度不断增加，酶浓度10%时水解度最高,为8.25%。
2.5 胰蛋白酶水解小麦蛋白正交试验
根据单因素试验结果，选取影响胰蛋白酶水解的4个因素，每个因素设3个水平做4因素3水平正交试验，试验结果见表1、表2、表3。
根据正交反应趋势分析，4因素对水解度影响的大小顺序是：pH值>温度>底物浓度>时间，其中，pH值影响显著,最佳试验方案应选A2B2C2D2(其中选择A2的原因是A1和A2对结果的影响不显著，但提高底物浓度可提高生产效率)，用A2B2C2D2最佳方案作试验得到的水解度为15.34％。
3 结论
由单因素试验，设计4因素3水平正交试验，试验结果表明，4因素对水解度影响的大小顺序是pH值>温度>底物浓度>时间，胰蛋白酶酶解最佳工艺条件：酶浓度为8%、底物浓度为1.5%、pH值为8.5、温度40 ℃、时间4 h，得到的水解度15.34％。
（编辑：孙崎峰，）
刘珍，河南工业大学生物工程学院，450052，河南郑州。
王卫国（通讯作者），单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2006-08-08
★ 河南省2004年科技公关项目，编号0424030026 |
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