孟凡玲 沙 伟 冯昌军
摘 要 采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对3个物候期（返青期、初花期、结荚期）4个品种苜蓿根进行过氧化物酶(POD)同工酶分析。初步研究表明，随着生长的不断进行所有品种酶带总数呈现递减的趋势，其中返青期酶带数多，酶活性强。表明在不同的生长时期要求有不同的酶类表达。
关键词 苜蓿；POD同工酶；物候期
中图分类号 Q814.9
A study on isozymes peroxidase of alfalfa in different growth period
Meng Fanling, Sha Wei, Feng Changjun
Abstract The isozyme peroxidase(POD) of three growth periods(green period, flower period, fruit period) in four cultivars of alfalfa was analysed by using polycrylamide gel electrophoresis .It showed that the POD isozyme bands decreased along with growth and the activity of POD isozyme was also different. The activity of POD isozyme is the highest in green period .The conclusion is different types of isozyme were expressed in different growth period.
Key words alfalfa；isozyme peroxidase(POD)；growth period
同工酶是指具有相同催化作用而分子结构不同的酶，是基因表达的直接产物[1]。过氧化物酶（POD）在植物中普遍存在, 作为一种适应酶，能反映体内代谢状况，POD在研究植物同工酶与植物生长发育的关系中涉及较多, 故可以通过对植物不同生长发育时期各器官的POD 同工酶特性的研究, 探究同工酶谱的变化与生长发育的关系,为生长发育的代谢调控提供参考[2]。Shannon J M[3](1968)认为，同工酶的存在与植物体生理生化的多变性、可变性及适应性有关。国内外学者曾将POD同工酶用于苜蓿种及品种间的鉴定[4]、抗寒性和抗旱性与生理过程的关系[5，6]、苜蓿品种与地理分布的相关性[7]等的研究中，但对苜蓿不同生长时期的同工酶研究未见报道。
本实验以苜蓿为材料，对其不同生长时期过氧化物酶酶谱的变化进行研究比较，以了解苜蓿不同生长时期过氧化物酶的表达机制，为苜蓿的大面积种植和推广应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
肇东、龙牧806、Doblone、Wl323苜蓿4个品种，编号分别为P1、P2、P3、P4，由黑龙江省畜牧所提供。
1.2 方法
1.2.1 取样
分别取苜蓿返青期（A1）、开花期（A2）、结荚期（A3）3个时期的根部。
1.2.2 制样
将样品用去离子水洗净并吸干水分，剪碎，分别称取0.2g放入研钵中，加入电极缓冲液（pH 值为8.3，20倍稀释）5ml，在冰浴下研磨至匀浆，1 000r/min离心20min，取上清液放在4℃冰箱中备用。
1.2.3 电泳
采用DYY-Ⅱ型稳压电泳仪，先制胶，分离胶浓度6%，pH值8.9；浓缩胶浓度4%，pH值为6.7。电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液，pH值为8.3，进样量20μl，电泳电压80～120V，电泳4h，保持温度0～4℃，并以0.25%的溴酚兰作为前沿指示剂，溴酚兰带到距离凝胶末端1cm处为止，取下胶板，用去离子水冲洗干净，然后染色。
1.2.4 染色
采用罗光华改良的联苯胺法[8]。
1.2.5 酶谱带迁移率(Rf)计算
Rf=酶带迁移距离(cm)/溴酚兰迁移距离(cm)[9]。
2 结果与分析
在返青期、初花期、结荚期分别对P1、P2、P3、P4等品种苜蓿根进行过氧化物酶同工酶的酶谱分析,结果见表1。由表1可知，随着生长时期的进行，相对应位点迁移率（Rf）变化趋势是先变小后变大；随着生长期的进程，酶带数有递减的趋势，酶的活性强弱上有不同程度的差异。
3个时期4个品种苜蓿根POD同工酶电泳图谱见图1。由表1、图1可以看出，3个时期4个品种苜蓿根共分离出8条POD同工酶带，酶带依次命名e1～e8，根据主酶带集中部位，按迁移率从负极到正极大致可分为Ⅰ（Rf＜0.2）、Ⅱ（Rf：0.2～0.35）、Ⅲ（Rf：0.35～0.45）、Ⅳ（Rf：0.45～0.55）4个酶区。
2.1 返青期
Ⅰ区有2条酶带，Rf为0.159、0.178，e1在品种P1、P2、P3、P4活性强，e2只有在品种 P3、P4表达，活性较强；Ⅱ区共有2条酶带，Rf为0.222、0.326，e3在P2、P3品种活性较强，在P1、P4品种活性最弱，e4只有在P1品种中有表达，活性最弱；Ⅲ区共有2条酶带，Rf为0.359、0.411，e5、e6在品种P2、P3、P4活性强；Ⅳ区共有2条酶带，Rf为0.463、0.522，e7、e8在品种P2、P4均有表达，但是活性弱，P3品种只有1条e7酶带，且活性弱。
2.2 初花期
Ⅰ区有3条酶带，Rf为0.024、0.146、0.190，e1在品种P3、P4活性最弱，e2在品种P2、P3活性强，P4品种次之，e3在品种P4中较强、P1品种次之；Ⅱ区共有1条酶带，Rf为0.244，e4在品种P1、P3、P4活性较强，P2品种活性最弱；Ⅲ区共有2条酶带，Rf为0.354、0.402，e5在品种 P2、P4 活性较弱，在品种 P1、P3 没有表达，e6在品种P1、P3活性强，P2品种活性中等，P4品种活性最弱；Ⅳ区只有1条酶带，Rf为0.458，在品种P1、P2、P3中活性强，P4品种活性较强。
2.3 结荚期
Ⅰ区有2条酶带，Rf为0.151、0.199，e1在品种P1、P2、P3、P4活性中等，e2在品种P4活性最弱，其它品种没有表达；Ⅱ区有2条酶带，Rf为0.229、0.338，e3在品种P3活性弱，品种P2活性最弱，其它品种没有表达，e4只有在品种P3有表达且活性较强；Ⅲ区只有1条酶带，Rf为0.423，e6在品种P1、P2、P4活性较强，在品种P3活性强；Ⅳ区没有酶带表达。
2.4 3个生长时期苜蓿根POD同工酶酶谱分析
在Ⅰ区3个生长时期均有2条或3条酶带表达；在Ⅱ区返青期和结荚期有2条酶带表达，初花期有1条酶带表达；在Ⅲ区返青期和初花期有2条酶带表达，结荚期有1条酶带表达；在Ⅳ区返青期有2条酶带，初花期有1条酶带，结荚期没有酶带表达，P1～P4的4个品种酶带总数在返青期分别为5、6、6、7；初花期分别为4、5、5、7；结荚期分别2、3、4、4，随着生长时期的进行所有品种的酶带总数有递减的趋势。
4个品种苜蓿根POD同工酶在Ⅲ区3个生长时期具有1条迁移率几乎一致的酶带始终显现，即编码e6酶带基因的表达时间长，可能是此酶在维持苜蓿正常生长发育过程中起着重要的作用，也可能是依赖这种酶消除正常代谢过程中始终产生的某一类过氧化物。Scandalios（1974）指出，酶是基因表达的产物，它们的基因表达皆随发育阶段或营养状况而改变[10]。
3 讨论
过氧化物酶同工酶在质[酶带数目和迁移率（Rf）]和量（酶活性）上的差异，是可以了解某一植物组织或器官的某些同工酶带在一定发育时期的出现以及在另一发育时期这些酶带则减弱或消失。这一现象是由于植物各器官在发育进程中酶分子的重新合成或酶前体物的活化所致；另一方面是由于酶分子在发育过程中的降解，促使某些酶带消失，归根到底是由于分化基因作用而产生了生理生化差异的缘故[11]。
4个品种苜蓿在3个时期迁移率、酶带数目均有不同程度的差异，表明过氧化物酶同工酶酶谱变化的差异在一定程度上受植物器官不同生长时期的影响。同工酶是基因表达的产物，基因的稳定性决定了同工酶酶谱稳定性。本研究中，4个品种苜蓿过氧化物酶在3个生长时期内酶带数不同，返青期酶带数最多，可能是苜蓿植物为适应温度条件而诱导体内过氧化物酶系统代谢改组的结果。初花期多于结荚期，可能这些基因所产生的酶类参与生长发育转变期的代谢调控, 与器官分化有关；或者是由于器官分化前代谢旺盛而产生的过氧化物类型多, 需要较多POD同工酶参与清除过氧化物的危害, 从而保持植物体细胞内环境的相对稳定。
参考文献
1 周光宇.同工酶简介[M]. 上海:上海农业科技出版社, 1979.26～27
2 梅慧生.植物同工酶研究进展[J].植物生理学通讯，1981（3）：1～7
3 Shannon J M.Plan Isoenzyme[J].Ann. Rev. Plant. Physiol.,1968,19:1 187
4 谢雪菊.中国苜蓿地方品种亲缘关系的研究.北京：中国农业大学硕士研究生论文，1996
5 Krasunk M G A. Hydrolytic enzyme differences in cold-tolerant alfalfa.Agron.J., 1978,70:579～605
6 周瑞莲，张承烈.水分胁迫下紫花苜蓿叶片SOD、CAT活性与抗逆行的关系[J].中国草地， 1991(2)：20～24
7 吴永敷.用同工酶分析法鉴定苜蓿品种的探讨[J].牧草与饲料，1988(4)：8～13
8 罗光华，王爱国.植物的凝胶电泳及活性的染色[J].植物生理学通讯，1983(6):44～45
9 郭尧君.蛋白质电泳实验技术(第一版)[M].北京：科学出版社，1999. 128～131
10 Scandalios J G. Ann.rev.Plant Phsiol.,1974，25：225～258
11 胡志昂.裸子植物的生化系统学(一)——松科植物的过氧化物酶[J]. 植物分类学报，1983，21(4)：423
（编辑：孙崎峰，）
孟凡玲，齐齐哈尔大学生命科学与工程学院，在读硕士，161006，黑龙江省齐齐哈尔市。
沙伟（通讯作者）、冯昌军，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2006-04-24 |
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