丁 丽 周维仁 章世元 宦海琳 徐小明 顾 金
近年来,随着抗生素、激素、防腐剂等药物性饲料添加剂在水产养殖中的广泛应用,在促进了养殖业发展的同时，也给人们带来了各种副作用，特别是抗生素的使用。长期使用抗生素造成了耐药菌增多、鱼体免疫功能下降、动物性食品残留、环境污染以及饲料加工业中交叉污染等各种负面影响。20世纪70年代，欧盟就开始暂停批准将几个重要的抗生素以亚治疗剂量加入动物饲料中，在2006年，欧盟监管委员会决定自2006年1月起在动物养殖业中禁用抗生素生长促进剂，由此，无毒、无副作用、无残留的绿色微生态制剂饲料添加剂应运而生。
1 水产用益生菌以及应用概况
1.1 微生态制剂定义
关于微生态制剂的定义，国内外众多学者根据其功能以及特点分别给出了不同的看法。Parke等(1974)首次将微生态制剂定义为有助于肠道菌群平衡的微生物和物质(可能含有抗生素),而Fuller（1989）认为，微生态制剂是一活的微生物饲料添加剂，通过改善肠道内菌群平衡而对动物产生有利的影响。但是，水产养殖中，微生物不仅影响养殖动物肠道内环境，也与外界环境有一定的关系。由此，微生态制剂又被定义为：一种通过改善与动物相关的或其周围的微生物群落结果来增加饲料的利用率或增强其营养价值，增强动物对疾病的应答能力或改善其周围环境的活菌制剂。随着研究的深入，现在广义微生态制剂不仅包括有益微生物，还包括一些能促进正常微生物群生长繁殖的物质所制备的制剂，能产生一定的生物效应或生态效应，包括益生菌、益生元和合生素，而我们通常所说的狭义的微生态制剂只包括益生菌。
1.2 益生菌作用机制
1.2.1 动物微生态理论学说
益生菌制剂在水产动物中的作用机理是建立在康白提出的动物微生态理论基础之上的，主要体现在以下的几个方面：①优势种群学说。形成的优势种群参与残饵、代谢废物等的分解，净化养殖环境，同时与致病菌开展营养及生态位的竞争，抑制致病菌的孽生。②微生物夺氧学说。有益菌菌种进入消化道后迅速生长繁殖，消耗肠内的氧气，使局部的氧分子浓度下降，从而恢复肠内微生物之间的微生态平衡。③膜菌群屏障学说，有益菌群与宿主粘膜上皮紧密结合生成致密性菌膜，形成微生物屏障起保护作用，也就是竞争拮抗作用。④“三流运转”理论(三流循环其主要内容是能量流、物质流及基因流的循环)。微生态制剂可以抑制腐败微生物的过度生长和毒性物质的产生，促进肠蠕动，维持膜结构完整，从而保证了微生态系统中基因流、物质流和能量流的正常运转。
1.2.2 益生菌在水产动物中的作用
1.2.2.1 营养作用
益生菌自身含有丰富的营养物质，还可在肠内合成多种维生素、氨基酸、蛋白质、促生长因子等，参与新陈代谢，加强营养物质代谢，促进水产动物生长。例如光合细菌（PSB）菌体中粗蛋白含量高达65.45%,另外菌体粗脂肪约7%，可溶性糖类约20%，粗纤维约3%；并且含有17种消化率较高氨基酸；PSB菌体还含有丰富的B族维生素、辅酶Q10、类胡萝卜素，其中辅酶Q10的含量为酵母的13倍；在酵母菌中,菌体含蛋白质46%~65%，氨基酸种类比较全面，且富含多种动物必需维生素和微量元素。
1.2.2.2 酶作用
一些益生菌在发酵或代谢过程中产生促生长类的生理活性物质，产生各种酶类并提高动物体内消化酶的活性等，如芽孢杆菌，它能产生具有较强酶活性的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶;同时还有能降解饲料中复杂化合物的酶,如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖异构酶等，且其代谢产物为多种氨基酸和维生素类物质，有助于养殖动物对食物的消化和吸收。乳酸杆菌、芽孢杆菌等多数好氧菌会产生超氧化物歧化酶，消除动物体内氧自由基,可以阻止毒性胺和氨的合成。除此之外，芽孢杆菌等可在动物肠道内产生氨基氧化酶及分解硫化物的酶类，降低血液及粪便中的氨、吲哚等有毒气体的含量，从而降低动物体内有毒物质的积累。
1.2.2.3 免疫作用
微生态制剂可以刺激胸腺、脾脏等免疫器官的发育,并能起到机体免疫激活剂的作用,有效提高抗干扰素和巨噬细胞的活性,通过产生抗体和提高噬菌作用活性等刺激免疫,增强T淋巴细胞和B淋巴细胞对抗原刺激的反应性,激发机体体液免疫和细胞免疫,从而增强机体免疫功能。许多研究显示,微生态制剂可增强单核吞噬细胞、多形核白细胞和自然杀伤细胞的活力,刺激活性氧、溶酶体酶和单核因子等因子的分泌,从而增强机体非特异性防御机能及启动特异性免疫应答;而有些微生物是良好的免疫激活剂,能通过促进B细胞产生抗体来提高免疫力和抗病力,对于鱼类等低等无脊椎动物而言主要是提高体液因子中的各种酶活力。
1.2.2.4 抗菌作用
益生菌进入动物体内后，一些需氧的微生物特别是芽孢杆菌能消耗肠道内的氧气，造成厌氧环境，降低氧化还原电势，有利于厌氧微生物的生长，且与致病菌争夺生存和繁殖空间、定居部位及营养素等，恢复优势菌群，从而使失调的菌群恢复到正常状态。动物肠道内的有益菌群分泌抑菌物质，如乳酸菌通过分泌细菌素、过氧化氢、有机酸等物质，使肠道内的pH值下降，其产生的特殊抗菌活性蛋白-乳酸菌素，能有效抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长。另一方面微生物与病原菌争夺营养或附着点，抑制其它微生物的生长，利于机体在内环境中形成一种生理性相对协调的平衡状态。有的微生物代谢过程中亦可产生具有抑制或杀死其它有害微生物的抗菌素，以及通过生物种群生态间的竞争，抑制养殖水体中有害致病菌的繁殖生长，预防水产动物疾病的发生。
1.2.2.5 降解作用
益生菌进入水体后，在其代谢过程中具有气化、氨化、硝化、反硝化、解磷及固氮等作用，能将养殖水体中有毒有害的气体（如氨气、硫化氢），养殖动物的排泄物、残存饲料、动植物残骸等有机物迅速分解为二氧化碳、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐等，进而被水体中的微藻类加以利用，起到净化水质的作用，增加水体透明度，降低COD，增加溶氧量，如芽孢杆菌能迅速降解进入养殖池的有机物，有效降低水中COD、BOD的含量,使水体中的氨氮与亚硝酸氮、硫化物浓度降低,有效地改良了水质。
1.3 水产养殖中常见益生菌种类
1.3.1 光合细菌(Photosynthetic bacteria, PSB)
PSB,属革兰氏阴性菌，是一类能进行光合作用而不产氧的特殊生理类群的原核生物的总称。根据在光合作用中是否产氧，PSB可以分为产氧光合细菌(Oxygenic photosynthetic bacteria)和不产氧光合细菌(Non-oxygenic photosynthetic bacteria)2大类群。产氧光合细菌为蓝细菌,不产氧光合细菌主要包括着色杆菌(Chromatiaceae)、外硫红螺菌(Ectothiorhodospiraceae)、紫色非硫细菌(Purple nonsulfur bacteria)、绿色硫细菌(Greensulfur bacteria)、多细胞丝状绿细菌(Multicellular filamentousgreen bacteria)、螺旋杆(Helicobacteraceae)、含细菌叶绿素的专性好氧菌等。光合细菌中的一些含硫光合细菌,能进行类似植物的光合作用来制造有机物，此类细菌所进行的光合作用主要是以H2S为供氢体,CO2碳源，其反应方程式如下：
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而非硫细菌则在无氧条件下以有机物(H2A)作为供氢体，以CO2为碳源，反应方程式如下：
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现已知的光合细菌包括1目、2亚目、4科、19属共约49种,一般以紫色非硫细菌和紫硫细菌较为普遍。
1.3.2 酵母菌(Microzyme)
酵母菌是一种典型的真核单细胞微生物，具有近乎完整的细胞结构,有细胞壁、胞浆膜、细胞浆、细胞核及其它内含物等。目前，用于饲料的主要有饲料酵母(Single Cell Protein，SCP)、酵母培养物(Yeast Culture,YC)、活性干酵母、酵母细胞壁、酵母水解物以及酵母硒等。
1.3.3 芽孢杆菌(Bacillus)
芽孢杆菌是一类好气或兼性厌氧细菌革兰氏阳性菌,在缺乏营养或遇不良环境时可形成内生孢子。芽孢杆菌稳定性较好,在储藏过程中以休眠孢子形式存在。目前允许饲用的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、缓慢芽孢杆菌（Bacillus lentus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheni-formis）、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium )、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、东洋芽孢杆菌(Bacillus toyoi)、芽孢乳杆菌(Lactobacillus sporogens)等,水产养殖上比较常用的有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheni-formis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)等。
1.3.4 乳酸菌
乳酸菌，动物肠道内正常菌群之一。目前已发现的这一类细菌在分类学上至少包括18个属，其中有益菌以乳杆菌属、双歧杆菌属为代表，是一种厌氧或兼气菌，其通过降解碳水化合物生成乳酸和其它有机酸，使动物肠道内的pH值下降，从而抑制其它微生物的生长和繁殖，并对动物的免疫和抗病能力产生一定影响。
1.3.5 硝化细菌(Nitrifying Bacteri)
硝化细菌是一类能降解氨和亚硝酸盐的自养型细菌,包括亚硝化菌属(Nitro-somonas)和硝化杆菌属(Nitrobacter)两个生理亚群。通常条件下,硝化细菌利用氨或亚硝酸盐作为主要能源,利用二氧化碳作为主要碳源的细菌。硝化细菌在氮的循环中将亚硝酸盐转化为硝酸盐而被藻类利用,从而起到净化水质的作用。
1.3.6 反硝化细菌
反硝化细菌是一类能利用亚硝酸盐氮等作氮源,有机质为碳源,且能进行自身繁殖的微生物，主要把硝酸或亚硝酸转变成氮气而释放出来，多用于处理底泥。在鱼虾池底层溶解氧低于0.5 mg/l，pH值8～9条件下，反硝化细菌利用底泥中有机物作为碳源，将底泥中硝酸盐转为无害的氮气排入大气中。
1.3.7 噬菌蛭弧菌(Bde1lovibrio bacteriovorus)
噬菌蛭弧菌,属蛭弧菌科，是一类寄生于其它细菌体内并能导致其裂解的细菌。蛭弧菌比通常的细菌小,有似细菌病毒(噬菌体)的作用,具有细菌特性,寄生和裂解(溶菌)宿主细菌是蛭弧菌独特的生物学特性。研究证实,蛭弧菌对沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、欧文菌属、变形杆菌属、弧菌属、球菌属等均有很高的裂解活性。尤其是对弧菌属、沙门菌属和志贺菌属。另外，蛭弧菌对自然河水中的副溶血弧菌、溶藻弧菌、海弧菌、河弧菌、鳗弧菌、拟态弧菌、嗜水气单胞菌、恶臭假单胞菌、屈挠杆菌、发光杆菌、伤寒沙门菌、大肠杆菌等均有显著净化作用。
1.4 益生菌在水产养殖上的应用
1.4.1 在鱼类养殖上的应用
Kozasa(1986)首次从土壤中分离出1株芽孢杆菌(Bacillustoyoi)添加到日本鳗鲡饵料中，降低了由爱德华氏菌引起的死亡率。Gatesoupe等(1998)也报道,先以芽孢杆菌作为饵料培养轮虫,之后以轮虫投喂大菱鲆,可以提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的增重率和存活率。张梁等（2007）用添加光合细菌的饲料喂养草鱼,能够显著加快草鱼的生长发育,降低饵料系数,42 d内相对生长率可提高61.7%；且增强草鱼肝脏及血清中碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。刘克琳等(2000)采用有益芽孢杆菌制成微生物添加剂投喂鲤鱼，结果发现该制剂促进鲤鱼免疫器官的发育；与对照组相比，试验组鲤鱼胸腺皮质增宽，巨噬细胞和粒细胞等密集且数量多，髓质细胞类同皮质，胸腺小体结构明显，且试验组鲤鱼胸腺内T、B淋巴细胞多；另试验组与对照组相比脾脏白髓内淋巴细胞密集形成的淋巴细胞岛多。Nikoskelainen等(2001)用含剂量分别为109、1012个/g鼠李乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）饲料喂养虹鳟51 d,后用杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)攻毒,结果对照组的死亡率为52.6%,109个/g组为18.9%，1012个/g组为46.3%,显示了良好的抗菌能力。曾地刚等（2004）在试验水体中加入嗜水气单胞菌对斑点叉尾■进行感染，同时在水体中加入噬菌蛭弧菌,当水中的噬菌蛭弧菌浓度达到105个/ml以上时有预防斑点叉尾■败血病的效果。草鱼肠道分离的短乳酸杆菌具有促进草鱼肠道乳酸菌数量增加,降低水和消化道中弧菌数量,调整养殖水体和肠道菌群构成的作用。
1.4.2 在虾养殖上的应用
Rengpipat S等（1998）用含Bacillus S11菌株的饵料饲喂斑节对虾90 d，对虾生长好、抗病能力强,用浓度为107 CFU/ml的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)菌液进行人工感染，对虾存活率比对照组高。在枯草芽孢杆菌对克氏原螯虾免疫影响的试验中，谢佳磊等（2007）研究发现，试验组(含枯草芽孢杆菌的饲料组)的血淋巴吞噬活性、血清溶菌活力、抗菌活力均高于对照组，且酚氧化酶活力也有所增加，促进克氏原螯虾免疫机能。经酵母菌发酵的对虾饵料可显著促进虾体对饵料的消化吸收和生长发育。侯树宇等(2004)研究以芽孢杆菌和乳酸菌为主体菌，并辅以放线菌组成的微生态复合菌制剂用于对虾养殖，模拟试验，结果显示，试验池水质各项指标均优于对照池。在对虾池中分别加入光合细菌、芽孢杆菌以及不同的微生态制剂，待其生长繁殖后测定氨氮、亚硝酸盐氮、COD值和pH值，发现制剂对虾池水质具有较好的改善作用。
2 益生菌对鱼类肠道菌群组成的影响
2.1 鱼类肠道菌群的形成
相关研究表明：在鱼类整个消化管，包括从食管到大肠，都有益生菌的存在。但是由于胃中的低pH值环境、幽门部胆汁环境等不适于大多数益生菌生存,所以在这些部位定植的益生菌很少,而大部分益生菌都定植于肠道之中，并且真正起作用的益生菌大部分也是肠道益生菌群。因此，水生动物肠道菌群的情况，可以反映整个动物体内微生态平衡的情况。鱼类同陆生动物不同，其肠道菌群是在出生之后建立的。鱼类幼体在早期发育阶段就被以受精卵的形式释放到水体之中。在胃肠道发育不完全、免疫系统不完善的情况下，幼体开始从水体中摄取食物，鱼类的鳃和口腔是水和饵料必经之路，因而水中和饵料沾染的细菌必然会带入体内，这些细菌从外界环境转移入鱼类体内，经过适应后定居下来，它们生长率和生理生化活性均会发生很大变化，并取得与鱼体保持生态平衡，成为共生成员的统一体，因此有许多学者认为肠道菌群起源于水环境或饵料，鱼类肠道菌群因鱼的栖息水域不同而有所不同。许多研究表明，淡水鱼类肠道内专性厌氧菌以A、B型Bacteroides（拟杆菌科）等为主，好氧和兼性厌氧细菌则以Aeromonas（气单胞菌属）、Enterobacteriaceae(肠杆菌科)等为主,鱼肠内细菌的数量基本在105~108个/g。
2.2 鱼类肠道菌群的数量和组成
鱼类肠道菌群的数量与组成因鱼的种类、栖息水域、是否摄饵和投饵时间、饵料状况和生理状况等而有所不同。Margolis发现，未投饵的16尾鳃鱼(Silurus asotus Linnaeus)中，有15尾没有肠道细菌,未投饵的3尾红点蛙(Salvelinus salvelinus L)也没有,但摄食2 h后的鱼,就能检测到许多肠道细菌。在肠道菌群数量上有研究报道指出,淡水鱼肠内细菌的数量基本在105~108个/g，而海水鱼肠内细菌的数量在106～108个/g。不同鱼类其肠道菌群组成不同。Matheis分析鲤科鱼类肠道菌群主要为假单胞菌和气单胞菌属。王红宁等（1994）报道，鲤肠道微生物种群有气单胞菌、大肠杆菌、需氧芽孢杆菌、酵母菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、梭状芽孢杆菌，其中需氧、兼性厌氧优势菌是气单胞菌和酵母菌，厌氧优势菌是拟杆菌。薛恒平（1997）等报道，肉食性鱼类肠道内的优势菌群为肠微球菌、贝内克菌群、弧菌等，其次为假单孢菌、气单孢菌；而草食性鱼类的肠道内有双歧杆菌、嗜酸杆菌等。赵庆新(2001)发现，鲤鱼肠道中有哈夫尼亚菌属、气单胞菌属、链球菌属、致病杆菌属、假单胞杆菌属、芽孢杆菌属等，其中前三者的量在106～107 cfu/g，且哈夫尼亚菌属最高，为鲤鱼肠道的优势菌群；后三者的量在105～106 cfu/g之间，相对而言是鲤鱼肠道内劣势菌群。
2.3 益生菌对鱼类肠道菌群的影响
对于鱼类来讲，要在肠道内建立有益的微生物菌群相当复杂。一般来说，刚孵出的鱼苗，肠道菌群较少，此时在水环境抑或饵料中引入益生菌，可优先占据吸附点，形成良好的肠内环境；另外，应激时引入益生菌，对形成优势菌群有利，当肠道内有害菌较多时先用抗生素清理肠道，再饲喂益生菌，能更有效地抑制病原菌，建立新的肠道优势菌群。陈勇等（2001）用喷涂了微生态制剂溢康素的饲料喂养鲤鱼，试验组鲤鱼肠道内外来菌群(芽孢杆菌、乳酸杆菌)得到了定植；肠道有益菌群(殴文氏菌、节细菌、变形菌、不动细菌等)得到了增殖，有害菌群(志贺氏菌、气单胞菌、弧菌、沙门氏菌等)的数量得到了抑制。尹军霞等(2007)在饲料中添加益生菌剂饲喂鲫鱼时发现，益生菌剂能有效改善鲫鱼肠道菌群，益生菌剂极显著减少鲫鱼肠道的好氧菌，极显著增加鲫鱼肠道的厌氧菌、双歧杆菌和乳酸杆菌,显著降低鲫鱼肠道的产气荚膜梭菌。王梦亮等（1999）在鲤鱼饲料中添加光合细菌后发现，试验组肠道中光合细菌最高检出数为4.78±0.75（lgn/g肠道内容物）且不为饲喂浓度的增加而增加。肠中大肠杆菌、拟杆菌的数量明显低于对照组，乳酸杆菌显著高于对照组，气单胞菌、双歧杆菌有增多趋势，但与对照组比较差异不显著。在鱼饲料中添加高剂量产乳酸细菌，可引起幼鱼肠道微生物群落组成的暂时变化，添加结束后的几天内，添加菌株显著减少，以至完全消失。
3 小结
尽管微生态制剂的研究在我国起步比较晚，且自身存在一些弊端，如菌体稳定性差、活性难维持、必须在消化道中达到一定数量、不能与抗生素同时使用、对突发病作用甚微、使用技术未掌握等，但是微生态制剂相对于其它抗病途径而言，因其对水产品无毒副作用、无残留和抗药性，同时又不污染环境，提高了水产动物的生产性能和抗病能力，仍然是抗生素最有潜力的替代品。微生态制剂的使用实际上是用科学手段使动物回到了自然状态下的肠道微生物平衡状态。益生菌功效的提高可以通过以下几种途径实现：筛选有效的菌株，对菌株进行基因改造，几株益生菌联合使用等，采用基因工程技术解决微生态制剂活菌失活问题，但是益生菌直接影响的对象是水产动物肠道菌群，因此在试验研究中加强对水产动物肠道菌群结构的研究，摸清微生态制剂作用机制，将会更好地为微生态制剂的广泛应用奠定基础。
（参考文献40篇，刊略，需者可函索）
（编辑：沈桂宇，）
丁丽，江苏省农业科学院畜牧研究所，210014，江苏南京市孝陵卫钟灵街50号。
周维仁(通讯作者)、宦海琳、徐小明，单位及通讯地址同第一作者。
章世元、顾金，扬州大学动物科学与技术学院。
收稿日期：2009-08-24 |
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