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刘永贵 李 义 王 玥 陈文典 孙 汉
摘 要 以0（对照组）、1、3、6 g/kg的剂量将嗜水气单胞菌海藻酸钠微胶囊冻干疫苗（菌含量为1.5×1012 cfu/g）添加于基础饲料中投喂中华绒螯蟹7 d，然后投喂对照组饲料。在停喂含疫苗的饲料后第0、1、2、3周，采样测定中华绒螯蟹血细胞呼吸爆发活性、血清超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)和溶菌酶(LSZ)活性，并在停喂含疫苗的饲料后第1周，以每千克体重1.2×107 cfu的剂量，体腔注射致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株，记录接种7 d后中华绒螯蟹的累计死亡率。结果显示：在停喂含疫苗的饲料后第0周和第3周，6 g/kg组的血细胞呼吸爆发活性显著增加(P<0.05)；在一些采样时段，3个试验组的血清SOD、PO及LSZ活性分别显著上升(P<0.05)。各试验组的蟹对嗜水气单胞菌的抵抗力明显增强。由此说明，投喂试验剂量的嗜水气单胞菌微胶囊疫苗能增强中华绒螯蟹的免疫机能。综合本试验结果并考虑添加成本，建议在生产中使用3 g/kg的添加剂量。
关键词 中华绒螯蟹；嗜水气单胞菌；微胶囊疫苗；免疫
中图分类号 S96
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)在我国水产养殖业中占有十分重要的地位，研发能增强免疫机能和抗病力的免疫增强剂，是预防和控制其病害的重要途径。已有研究表明，注射适量的嗜水气单胞菌灭活疫苗能增强中华绒螯蟹的某些免疫指标的活性及抗感染能力[1-2]，口服嗜水气单胞菌灭活疫苗也能提高中华绒螯蟹的部分免疫指标的活性，但不具免疫保护作用[2]。目前，微胶囊技术在人和畜禽口服疫苗研究中的应用日益广泛，有关水产动物微胶囊口服疫苗的研究也取得了一定的进展[3-6]。本文报道嗜水气单胞菌海藻酸钠微胶囊口服疫苗对中华绒螯蟹免疫机能影响的试验结果，以期为甲壳动物微胶囊疫苗的研究与应用提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
健康、活泼的中华绒螯蟹购于江苏省吴江市某水产养殖场，平均体重（22±0.5） g。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)CL99920菌株由浙江省淡水水产研究所惠赠，在普通液体培养基中活化后备用。
试剂及药品除特别注明的外，均为国产分析纯。
基础饲料为上海协鑫水产科技有限公司生产的幼蟹饲料。
1.2 方法
1.2.1 嗜水气单胞菌微胶囊疫苗的制备
将嗜水气单胞菌CL99920菌株接种于液体培养基中,28 ℃摇床培养24 h,加入终浓度为0.2%的福尔马林灭活12 h,用灭菌生理盐水离心(1 500 r/min,10 min)洗涤3次，确认灭活完全后用灭菌生理盐水配成1.0×1012 cfu/ml浓度，即成嗜水气单胞菌灭活疫苗。然后，以海藻酸钠为壁材，采用乳化法(工艺条件为：海藻酸钠为2%，菌胶比1：6，搅拌速度为600 r/min，乳化时间为15 min)对嗜水气单胞菌灭活疫苗进行微胶囊化，冻干即成嗜水气单胞菌海藻酸钠微胶囊冻干疫苗。经测定，该微胶囊疫苗的菌含量为1.5×1012 cfu/g。取0.1 g 微胶囊冻干疫苗溶于10 ml 灭菌生理盐水中，以0.2 ml/只的剂量，对10只外观健康的中华绒鳌蟹体腔注射，观察2周，证明疫苗安全后备用。
1.2.2 试验饲料的制备
将嗜水气单胞菌微胶囊疫苗以每千克饲料0(对照)、1、3、6 g的剂量添加至预先粉碎的基础饲料中，重新制成颗粒饲料备用。
1.2.3 试验设计
试验蟹经过1周暂养后，挑选规格整齐、健康的个体随机分组饲养于12只直径70 cm、高100 cm、水深45 cm的圆形玻璃钢桶内,每只桶放养18只。所有养殖桶均连接成一个自动的循环水养殖系统，每天投喂饲料3次，投喂至饱食状态，投喂时间为早上7:00、中午11：00和傍晚6：00，试验期间水温控制在（23±1.5） ℃,并用增氧泵连续增氧。试验设0、1、3和6 g/kg剂量分成4个处理组，每个处理组设3个重复。3个试验组在投喂含疫苗的饲料7 d后改投对照组饲料。在停喂含疫苗的饲料后0、1、2、3周，在3个处理组的每1重复中随机采取2只中华绒螯蟹采集血淋巴液，依检测指标不同分别制成抗凝血和血清备用。抗凝血（使用ACD抗凝剂[7]）、血清的制备按常规方法进行。
1.2.4 呼吸爆发活性的测定
参照Song等[8]的氯化硝基四氮唑蓝（NBT）还原法适当修改。以相对超氧阴离子（O2－）产量即试验组OD630 nm值与对照组OD630 nm值的比值来表示呼吸爆发活性的增减。
1.2.5 血清SOD活性的测定
按照SOD测定试剂盒(南京建成生物研究所生产)的要求进行。该试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定SOD活性。SOD活性定义为：每1 ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD的量为1个亚硝酸盐单位(NU)。
1.2.6 血清PO活性的测定
参照Ashida[9]的方法适当修改。在96孔酶标板的微孔中加入28 ℃预温的0.1 mol/l pH值6.0磷酸钾盐缓冲液300 μl、0.01 mol/l L-dopa(Sigma) 10 μl及待测血清10 μl，混匀后立即用酶标仪测定反应体系的初始吸光值，然后每隔2 min读取一次吸光值，共读取10次。酶活性以试验条件下，每分钟OD490 nm增加0.001 定义为1 个酶活性单位(U)。
1.2.7 血清LSZ活性的测定
按照Hultmark[10]的方法适当修改。以溶壁微球菌(Micrococcus lysodei- kticus)冻干粉(由苏州大学基础医学与生物科学学院提供)为底物，用0.1 mol/l、pH值6.4的磷酸钾盐缓冲液将底物配成一定浓度的悬液(OD570 nm≈0.3)，取3 ml该悬液与50 μl待测血清于试管中混匀，测初始吸光值(A0)，然后置于28 ℃水浴温育45 min，取出后立即置于冰浴中10 min 终止反应，测570 nm 处吸光值(A)。溶菌酶活性(UL)=(A0－A)/A。
1.2.8 免疫保护率的测定
停喂试验组饲料后第2周，在每个处理组中取蟹9只，以每千克体重1.2×107 cfu的剂量，体腔注射致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株，记录接种10 d后中华绒螯蟹的累积死亡率。免疫保护率（％）=(对照组死亡率－免疫组死亡率)/对照组死亡率×100。
1.2.9 统计分析
数据用统计软件SPSS10.0处理，单因素方差分析差异显著时，用Duncan's法检验进行多重比较，P<0.05表示差异显著。
2 结果
2.1 嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹血细胞呼吸爆发的影响（见图1）
螯蟹血细胞呼吸爆发的影响
如图1所示，在停喂含疫苗的饲料后第0周和第3周，6 g/kg组显著高于对照组、1 g/kg组及3 g/kg组(P<0.05)，而其它3个处理组之间差异不显著(P>0.05)；在停喂含疫苗的饲料后第1周和第2周，4个处理组之间差异均不显著(P>0.05)。
2.2 嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹血清SOD活性的影响（见图2）
如图2所示,在停喂含疫苗的饲料后第0周,1 g/kg组的SOD活性显著高于对照组(P<0.05)，但与其它2个试验组间差异不显著(P>0.05)；在停喂含疫苗的饲料后第1周，3 g/kg组的SOD活性显著高于对照组(P<0.05)，但与其它2个试验组间差异不显著(P>0.05)；在停喂含疫苗的饲料后第2周和第3周，3个试验组的SOD活性均显著高于对照组(P<0.05)，但3个试验组之间差异不显著(P>0.05)。
2.3 嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹血清PO活性的影响（见图3）
螯蟹血清PO活性的影响
如图3所示,在停喂含疫苗的饲料后第0周,6 g/kg组PO活性显著高于对照组、1 g/kg组及3 g/kg组(P<0.05)；在停喂含疫苗的饲料后第1周，3个试验组的PO活性均显著高于对照组(P<0.05)，其中1 g/kg组也显著高于6 g/kg组(P<0.05)；在停喂含疫苗的饲料后第2周，6 g/kg组的PO活性显著高于对照组和1 g/kg组(P<0.05)，但与3 g/kg组差异不显著(P>0.05)；在停喂含疫苗的饲料后第3周，3个试验组的PO活性均恢复至对照组水平。
2.4 嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹血清LSZ活性的影响（见图4）
如图4所示,在停喂含疫苗的饲料后第0周,3个试验组的LSZ活性均显著高于对照组(P<0.05),但3个试验组之间差异不显著(P>0.05)；在停喂含疫苗的饲料后第1周,3 g/kg组和6 g/kg组的LSZ显著高于对照组和1 g/kg组(P<0.05),但1 g/kg组与对照组,3 g/kg组与6 g/kg组之间的差异均不显著(P>0.05)；在停喂含疫苗的饲料后第2周后，3个试验组的LSZ活性均恢复至对照组水平。
2.5 嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹免疫保护率的影响（见表1）
如表1所示,3个试验组中华绒螯蟹对致病性嗜水气单胞菌攻毒的死亡率均明显低于对照组,以3 g/kg组的死亡率最低，免疫保护率最高(71.43%)。
3 讨论
3.1 嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹血细胞呼吸爆发和血清SOD活性的影响
研究表明，甲壳动物血细胞呼吸爆发产生的活性氧（包括O2－）在杀菌活性中起着重要作用[11]，但活性氧自由基的过度产生也会损伤宿主细胞，于是宿主通过SOD来清除体内过多的O2－自由基[12]。因此，O2－产量和SOD活性常被作为衡量甲壳动物免疫状态的重要指标。
迄今，有关细菌疫苗对甲壳动物血细胞呼吸爆发活性影响的研究尚未见报道。本试验结果表明，口服嗜水气单胞菌微胶囊疫苗能增强中华绒螯蟹的呼吸爆发活性。在停喂疫苗后第0周和第3周，6 g/kg组的呼吸爆发活性显著高于对照组、1 g/kg组及3 g/kg组，而在停喂疫苗后第1周和第2周，6 g/kg组与其它3个处理组之间差异却不显著。
嗜水气单胞菌灭活疫苗对中华绒螯蟹血清SOD活性影响的研究已有报道。徐海圣[1]、沈锦玉等[2]分别报道注射或口服嗜水气单胞菌灭活疫苗，均能增强中华绒螯蟹血清SOD活性。本试验结果显示，在所有采样时段，3个试验组的SOD活性均高于对照组，其中，在停喂疫苗后第0周和第1周，分别是1 g/kg组和3 g/kg组显著高于对照组,而在停喂疫苗后第2周和第3周,则是3个试验组均显著高于对照组。由此表明,口服嗜水气单胞菌微胶囊疫苗能显著地增强中华绒螯蟹血清SOD活性。这与徐海圣[1]和沈锦玉等[2]的试验结果一致。
分析本试验结果，我们推测嗜水气单胞菌微胶囊疫苗引发中华绒螯蟹血细胞呼吸爆发可能需要一定的剂量，过低不能引发。另一方面，随着呼吸爆发过程中O2－产量的显著增加，为保护宿主细胞不受损伤，SOD活性开始增加，由于SOD清除了过多的O2－，使得在一段时间内呼吸爆发活性恢复到正常水平，但随着时间的进一步推移，疫苗再次引发血细胞呼吸爆发，使O2－产量显著增加。
3.2 嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹血清PO和LSZ活性的影响
PO是甲壳动物最重要的免疫保护酶之一。徐海圣[1]报道注射嗜水气单胞菌灭活疫苗，中华绒螯蟹PO活性有所增加。本试验发现，投喂嗜水气单胞菌微胶囊疫苗也能显著地提高中华绒螯蟹血清PO活性。
LSZ是甲壳动物非特异性免疫系统的重要成分，能水解革兰氏阳性细菌细胞壁中粘肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被释放出来，形成一个水解酶体系，破坏和消除侵入体内的异物，从而担负起机体防御的功能。沈锦玉等[2]发现，口服嗜水气单胞菌灭活疫苗，中华绒螯蟹血清LSZ活性显著上升。曹剑香等[13]的试验表明，凡纳滨对虾口服溶藻弧菌疫苗后血清LSZ活性显著增加。本试验结果与上述研究结果一致。
3.3 嗜水气单胞菌微胶囊疫苗对中华绒螯蟹抗感染能力的影响
徐海圣[1]、沈锦玉等[2]先后报道，注射嗜水气单胞菌灭活疫苗对中华绒螯蟹的免疫保护率可分别达到74.7%和74.5%。但是，沈锦玉等[2]发现，口服嗜水气单胞菌灭活疫苗对中华绒螯蟹没有免疫保护作用。本试验结果表明，对中华绒螯蟹投喂3种试验剂量的嗜水气单胞菌微胶囊疫苗均具有不同程度的保护作用，以3 g/kg剂量的免疫保护率最高，达71.43%，与徐海圣[1]和沈锦玉等[2]注射嗜水气单胞菌灭活疫苗的效果相当，而大大高于沈锦玉等[2]的口服试验效果。本研究表明，嗜水气单胞菌灭活疫苗经天然的高分子多糖海藻酸钠微胶囊化后，能有效地抵抗宿主胃酸和消化酶的破坏，并在肠道缓释后有效地发挥疫苗的刺激作用。
参考文献
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（编辑：徐世良，）
刘永贵，苏州大学医学部基础医学与生物科学学院，215123，江苏省苏州市工业园区仁爱路199号。
李义（通讯作者）、王玥、陈文典、孙汉，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-02-27
★ 苏州市科技攻关项目（SNG-0714）
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