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韩 璐 王彦波 王琼萍 韩剑众
摘 要 以罗非鱼为试验动物，研究细菌多糖对其血清总蛋白、白蛋白、溶菌酶和补体C3含量以及髓过氧化物酶活性的影响。结果显示，与对照组比较，试验组血清总蛋白和白蛋白含量没有显著变化，但是补体C3含量以及髓过氧化物酶活性显著升高(P<0.05)。此外，饵料中添加0.10和0.20 g/kg细菌多糖的试验组溶菌酶的含量比对照组显著提高(P<0.05)，但是试验组间差异不显著。试验表明饵料中添加一定浓度的细菌多糖可以显著提高罗非鱼血清中部分免疫指标，对增强罗非鱼的免疫功能具有重要的作用。
关键词 细菌多糖；罗非鱼；免疫；多糖
中图分类号 S816.7
细菌和病毒性传染病是危害水产品健康生产的因素之一，随着水产养殖业日趋集约化发展，传染性疾病的预防显得更加重要。实践证明，包括抗生素在内的传统化学药物治疗很难持续发挥作用，而且存在药物残留等诸多问题。由于水生动物终生生活在水这一特殊的介质中，所以通过疫苗进行的免疫接种预防在水产养殖实际应用中存在着一定的局限性。因此，如何保证免疫成功是生产中必须考虑的问题（黄艳平，2004）。包括多糖在内的免疫增强剂能提高动物自身免疫力，解除动物免疫抑制，增强动物对细菌和病毒性传染病的抵抗力，因此其在动物生产中的研究与应用日益引起国内外的重视（温州瑞, 2004）。研究表明，来自于细菌细胞壁的葡聚糖、脂多糖和肽聚糖等多糖具有激活水生动物非特异性免疫系统的功能，细菌多糖在水产养殖中的应用和机理探讨已成为目前研究的热点，然而细菌多糖对罗非鱼血清免疫功能影响的研究鲜有报道。鉴于此，本研究以罗非鱼为试验动物，研究饵料中添加一定浓度的细菌多糖对其血清总蛋白、白蛋白、溶菌酶和补体C3含量以及髓过氧化物酶活性的影响，旨在为细菌多糖在罗非鱼养殖中的应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
罗非鱼(Oreochromis niloticus)由浙江跃腾水产食品有限公司提供,经2.5%的食盐水浸泡消毒,暂养14 d后随机选择健康罗非鱼360尾，平均体重(3.0±0.6) g，备用。产多糖细菌XW-115由本实验室分离并保存。活化后的菌株37 ℃培养24 h，10 000 r/min离心收集上清液。采用旋转蒸发仪减压浓缩至适当体积后透析，经检测无单糖后第二次浓缩，并通过三氯乙酸除蛋白，再经20% H2O2脱色、乙醇分步沉淀和冷冻干燥，得到含量约为85%的多糖粗品备用。基础饵料参照NRC（1993）罗非鱼营养需要自行配制，基础饵料配方以及部分营养水平实测值参见表1。
1.2 试验设计与方法
采用单因子设计，罗非鱼随机分为4组（对照组、T-1组、T-2组和T-3组），每组3个重复,每个重复30尾。其中对照组、T-1组、T-2组和T-3组分别在基础饵料中添加0、0.05、0.10和0.20 g/kg的细菌多糖。试验在密闭式过滤循环系统的水族箱（100 cm×50 cm×50 cm）中进行，整个试验期间控制水温25～28 ℃，溶解氧6.0 mg/l以上。每天换水1次，换水量为原来水量的1/3。每天8：00、13：00和18：00按体重的3％～5%进行3次投饵，试验周期40 d。饲养试验结束后，停饲24 h,每个水族箱中随机取10尾鱼，经MS-222（1：2 500， Sigma）麻醉后通过尾锥静脉采取血样，分别放置静置12 h后，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，取上清液（即血清）于1.5 ml 离心管中贮存于-80 ℃备用。
血清总蛋白测定采用考马斯亮兰法，白蛋白测定采用溴甲酚绿比色法。血清中溶菌酶含量的以溶壁微球菌（Micrococcus flavus NCIMB8166）为底物，参照Parry等(1965)的方法利用酶标仪（Thermo Multiskan MK3，USA）测定。血清中补体C3的含量通过英国RX Daytona全自动生化分析仪利用C3免疫浊度试剂盒（宁波慈城）测定。血清髓过氧化物酶活力测定参照Kumari等（2005b）的方法，定义为每升血清在30 ℃的反应体系中分解1 μmol H2O2为1个酶活力单位（U）。
1.3 统计分析
所有数据均采用SAS（version 6.04）软件进行统计分析，并参照显著性水平0.05作为各项结果的差异显著性判断标准。
2 结果
2.1 血清总蛋白与白蛋白含量测定（见图1）
由图1可见，与对照组相比，添加细菌多糖的试验组血清总蛋白和白蛋白含量虽然有不同程度的提高，但是差异均不显著（P>0.05）。
2.2 血清溶菌酶含量测定（见图2）
从图2可见,一定浓度的细菌多糖可以显著提高罗非鱼血清溶菌酶的含量,其中试验组T-2和T-3血清溶菌酶的含量分别为(77.27±4.27)和(78.05±3.38) mg/ml,显著(P<0.05)高于对照组[(66.77±4.57) mg/ml]，但是试验组之间差异不显著。与对照组比较,饵料中添加0.05 g/kg的细菌多糖并不能显著影响罗非鱼血清中溶菌酶的含量。
2.3 血清补体C3含量测定（见图3）
从图3可见，与对照组和试验组T-1比较，添加0.10和0.20 g/kg细菌多糖的试验组T-2和T-3可以显著（P<0.05）提高血清中补体C3含量，但是试验组T-2和T-3之间差异不显著。此外，试验组T-1与对照组相比也差异显著（P<0.05）。
2.4 血清髓过氧化物酶活力测定（见图4）
从图4可见，与对照组相比，细菌多糖显著（P<0.05）提高了罗非鱼血清髓过氧化物酶活力，而且随着饵料中多糖浓度的增加，髓过氧化物酶活力呈现升高的趋势，但是试验组T-2和T-3之间差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
同其它脊椎动物一样，鱼类免疫系统包括先天性的或非特异性的防御系统，以及获得性的或特异性的防御系统。但与哺乳动物不同，鱼类的免疫系统中非特异性免疫机制对疾病起着非常重要的作用（Landot，1989），存在于鱼类血液或粘液中的具有非特异性抵抗作用的分子包括溶菌酶、补体等（聂品，1997）。溶菌酶是在鱼体抵抗感染性致病菌的最前沿防御机制中起着重要作用，主要存在于鱼类的粘液、血清、吞噬细胞和单核细胞的胞浆内（Ellis，1999）。病原体入侵时，可刺激鱼血液中溶菌酶浓度的升高，溶菌酶通过酶解病原体细胞壁的粘多糖导致病原细胞的破裂, 尤其是对革兰氏阳性细菌或者某些特定的细菌细胞具有较好的溶解效果。Kumari等（2006）研究表明，日粮中添加β-1，3葡聚糖可提高鲶鱼血清溶菌酶活力，Misra等（2006）的研究得到了同样的结果。本试验结果表明，一定浓度的细菌多糖同样可以显著提高罗非鱼血清溶菌酶的含量。补体同样是鱼类抵抗微生物感染的重要成分，由具有酶活性的球蛋白组成，血清中补体C3是补体系统的主要成分。补体经激活后主要通过攻膜复合物完成细胞溶解或促进细胞吞噬作用，并以此来防御病原菌的入侵。Kumari等（2005b）在日粮中添加高剂量的维生素C可提高鲶鱼血清中补体C3的含量。Misra等（2006）通过多次注射β-葡聚糖也可提高补体C3含量。本试验结果表明，饵料中添加细菌多糖可以显著提高罗非鱼血清中补体C3含量，而且一定浓度内呈现剂量效应，这对提高罗非鱼的免疫功能具有重要的作用。
髓过氧化物酶存在于中性白细胞中，是鱼体内一种重要的氧化酶，能够利用氧化性基团，如H2O2等产生具有更强杀菌效果的次氯酸(Dalmo等，1997)，这个过程对杀灭病原微生物具有重要的作用。Kumari等(2005a)的研究表明，免疫抑制剂环磷酰胺（cyclophosphamide）可抑制亚洲鲶鱼髓过氧化物酶活性，从另一个侧面证明了髓过氧化物酶的免疫功能。Kumari 等(2005b、2006)在鲶鱼日粮中添加高剂量的维生素C和β-1，3葡聚糖同样证实了可增强髓过氧化物酶活性。本试验结果同样证明了饵料中添加一定浓度的细菌多糖可以显著提高罗非鱼血清中髓过氧化物酶的活力，对增强罗非鱼的免疫功能，抵抗病原微生物的入侵具有重要的作用。此外，本研究结果显示一定浓度的细菌多糖对罗非鱼血清总蛋白和白蛋白的含量没有显著的影响，这表明罗非鱼具有自身稳定调节系统，可以保持血清总蛋白和白蛋白含量处在一定的稳态。
参考文献
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（编辑：徐世良，）
韩璐，浙江工商大学食品质量安全系 浙江省食品安全重点实验室，310035，杭州。
王彦波(通讯作者)、王琼萍、韩剑众，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-03-16
★ 浙江省新苗人才计划项目资助（No. 2007R40G2050003）
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