Chalor Limsuwan Niti Chuchird Watchariya Purivirojkul Phanwalai Jantarapan 谭青松
摘 要 在实验室条件下研究了强化爱渔灵对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）生长、存活和免疫反应的影响。生长实验设计了三种颗粒饲料，分别添加不同含量的强化爱渔灵（0％、0.05％和0.1％），每个处理有6个重复，每个重复对应1个鱼缸，其中有25尾虾。生长实验进行60 d，期间每天投喂实验饲料4次,日投饵率为3％。实验结果表明,生长实验40 d后,0.1%强化爱渔灵组虾体重(16.76±1.33) g,显著高于0.05％强化爱渔灵组(15.84±0.99) g和对照组(15.40±1.19) g的体重（P<0.05）。两个实验组之间成活率(97.18%~97.60％)没有显著差异，但显著高于对照组的成活率（83.20％）（P<0.05）。通过总血细胞计数（THC）、吞噬百分率、酚氧化酶活力以及杀菌活性等评价了各处理组虾的免疫力。结果表明，0.1％添加组的THC值和吞噬百分率以及酚氧化酶活性显著高于0.05％添加组和对照组。0.1％添加组和0.05％添加组杀菌活性的血清稀释度为1：16，而对照组为1：8。生长实验60 d后，对各处理组的虾肌肉注射哈维病毒，两个实验组均未发现死亡率，而对照组的死亡率达43.33％。同时，用白斑综合症病毒感染虾，两个强化爱渔灵添加组在感染7 d后的死亡率达到100％，而对照组的死亡率在6 d内就达到100％。各处理组虾在感染黄头病毒后的死亡率结果与白斑综合征病毒感染实验结果类似。本研究表明，在饲料中添加0.1％强化爱渔灵可显著改善凡纳滨对虾的生长、成活率以及免疫力。
关键词 强化爱渔灵；β－环糊精半胱胺盐酸盐；凡纳滨对虾；免疫
中图分类号 S816.7
当前，原产于美洲中部和南部太平洋沿岸的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）已成为泰国、台湾和中国的主要对虾养殖品种（Lin等，1999）。自2001年来，凡纳滨对虾养殖已经遭遇了严重的疾病问题并导致虾的产量下降（Cheng等，2005）。很多学者试图通过增强对虾的非特性免疫力来解决疾病问题。使用免疫增强剂是提高虾免疫力的另一途径（Purivirojkul等，2006）。强化爱渔灵（含27％ β-环糊精半胱胺盐酸盐及0.1％维生素E，华扩达生化科技有限公司生产）可作为一种免疫增强剂。半胱胺盐酸盐在草鱼（Ctenopharyngodon idullus）中已经得到成功应用,可诱导草鱼体内的生长激素分泌从而促进生长,并能促进IgG、IgA和IgM的生成(Xiao等,2003)。但在虾的养殖中,关于强化爱渔灵的应用尚未有研究报道。基于在鱼类研究的结果,我们推测强化爱渔灵中的半胱胺盐酸盐会促进虾的生长和免疫力。本研究旨在探讨强化爱渔灵添加量对凡纳滨对虾生长、成活率以及免疫力的影响,从而用于对虾养殖。
1 材料和方法
1.1 实验动物
凡纳滨对虾（11～12） g购自泰国Chantaburi省的一个商品养殖场。1 500尾虾转移到Kasetsart大学水产学院水产养殖事业研究实验室的玻璃纤维缸中进行暂养以适应环境，14 d后用于正式实验。暂养和实验期间的水体盐度为25 ppt。
1.2 试验设计
1.2.1 实验1——强化爱渔灵对凡纳滨对虾生长和成活率的影响
为确定饲料中添加强化爱渔灵改善虾生长和成活率的效果，实验设计了3个处理组，分别为0.05％、0.1％强化爱渔灵添加组以及对照组，每个处理设6个重复。每个重复有25尾虾（11～12） g，养殖于500 L的鱼缸中。生长试验期间，每天用含不同强化爱渔灵的颗粒饲料投喂各实验组4次，日投喂率为3％，生长实验共进行60 d。实验期间投喂率根据虾体重进行校正。每周监测一次pH值、溶解氧（DO）、氨氮、亚硝酸盐等水质指标，每20 d记录1次各处理组的生长和成活率。
1.2.2 实验2——强化爱渔灵对凡纳滨对虾免疫指标的影响
实验采用3种处理：0.05％、0.1％强化爱渔灵组和对照组，每个处理（6个重复）有150尾虾。实验共进行50 d,每10 d测定各组的总血细胞、吞噬百分率、酚氧化酶活性以及杀菌活性等免疫指标。
血淋巴样品准备：用含1.5 ml抗凝剂（K-199＋5％ L-半胱氨酸）的注射器从虾的第3对步足根部采血，每尾虾采血0.5 ml。
1.2.2.1 总血细胞
采集血淋巴后，用血球计数器计数血细胞的个数（每毫升中的细胞数目）。
1.2.2.2 吞噬作用
吞噬活性测定参照Itami等（1994）的方法略作修改。从虾的第3对步足基部抽取200 μl血淋巴并与80 μl消毒过的抗凝剂混合，然后用虾生理盐水稀释，将有活力的细胞调节其浓度为1×106 个/ml。取200 μl细胞悬浮液滴加到盖玻片上；20 min后，移除悬浮液，并用虾生理盐水冲洗3次；在盖玻片上加入热灭活酵母，并孵育2 h；孵育后移除热灭活酵母，用虾生理盐水冲洗5次，用100％甲醛固定。
计数200个血细胞。然后按下列公式计算吞噬活性（以吞噬百分比表示）：
1.2.2.3 酚氧化酶活性测定
实验方法参考Supamattaya等（2000）等的方法做了修改。抽取血样后，血细胞用虾用生理盐水冲洗3次（1 000 r/min，4 ℃，10 min）。血细胞溶解物（HLS）的制备如下：将血细胞置于pH值7.4的二甲砷酸盐缓冲溶液中,然后在30 amplitute下超声波破碎5 s，再将悬浮液在10 000 r/min，4 ℃下离心20 min。收集上清液作为HLS。取200 μl HLS溶液与200 μl 0.1％胰蛋白酶二甲砷酸盐缓冲溶液混合,再与200 μl 4 mg/ml的L-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）（作为底物）混合。酶活性测定在490 nm波长下进行。HLS中蛋白质浓度的测定参照Lowry等（1951）的方法进行。酚氧化酶活性的计算按单位时间和单位质量蛋白质的光密度（OD）增加值进行。酚氧化酶活性单位为：
1 U＝△OD490/（min·mg蛋白质）。
1.2.2.4 杀菌活性
将每尾虾的血液分离出血清，然后用2.6％的NaCl溶液按以下比例稀释血清：1：2、1：4、1：16、1：32。每种稀释液取0.5 ml 作为实验组，并以0.5 ml NaCl溶液作为对照。取0.5 ml哈维弧菌溶液(配制方法见实验3内容部分)加入到各个血清稀释液和对照液中。将混合液在室温下孵育3 h。然后采用涂抹法计数细菌数量。结果按如下方法表达：在孵育3 h后,细菌数目减少至对照组一半时的稀释浓度即为该组的杀菌活性。
1.2.3 实验3——强化爱渔灵对哈维弧菌、白斑综合症病毒及黄头病毒感染后虾成活率的影响
试验虾摄食60 d后，取60尾进行哈维弧菌攻毒实验。哈维弧菌有毒菌株事先用胰酶大豆琼脂和1.5％ NaCl(w/v)溶液培养。实验中，每尾虾肌肉注射0.1 ml 哈维弧菌悬液（2×105 CFU/ml，48 h LD50）。统计其后7 d中各组累计死亡虾数目。
从实验用虾中取60尾进行白斑综合症病毒（WSSV）攻毒实验。攻毒采用投喂已感染白斑综合症病毒的凡纳滨对虾肉的方式，投喂量为受攻毒虾体重12%。统计其后7 d内各组虾的累计死亡数。
同时，还对实验用虾进行了黄头病毒攻毒实验。每个处理取60尾虾，攻毒采用投喂已感染黄头病毒的凡纳滨对虾肉的方式，投喂量为受攻毒虾12%体重。统计其后7 d内各组虾的累计死亡数。
1.3 统计分析
对所有数据进行单因素方差分析，再进行Duncan's法多重比较。显著性水平为P<0.05。
2 实验结果
2.1 实验1——强化爱渔灵对凡纳滨对虾生长和成活率的影响（见表1）
实验虾摄食40 d后，0.1％强化爱渔灵组的平均体重显著(P<0.05)高于0.05％添加组和对照组。0.1％和0.05％添加组的成活率没有显著差异，但是均显著(P<0.05)高于对照组。
2.2 实验2——强化爱渔灵对凡纳滨对虾免疫指标的影响
对总血细胞数、吞噬百分率、酚氧化酶活性以及杀菌活性等免疫指标进行了测定结果见表2、表3。实验期间水质条件如下：水温（28±1） ℃，pH值7.8～8.0，盐度为25 ppt。
2.2.1 总血细胞计数
当摄食20 d后，0.1％强化爱渔灵添加组的总血细胞数达到13.9±0.76（×106 个/ml），显著（P<0.05）高于0.05％添加组和对照组。而摄食达到30 d以上，则0.1％和0.05％添加组的总血细胞数均显著(P<0.05)高于对照组(见表2)。
2.2.2 吞噬百分率
摄食20 d后，0.1%强化爱渔灵添加组的吞噬百分率显著（P<0.05）高于0.05％添加组和对照组，各组的吞噬百分率值分别为(24.72±0.62)%，(23.79±0.36)%和(22.11±0.74)%。
2.2.3 酚氧化酶活性
摄食10 d后，0.1％强化爱渔灵添加组的酚氧化酶活性达到(342.82±109.17) U,显著高于0.05％添加组和对照组的酶活性,二者的酶活性分别为(315.11±19.90)和（279.27±81.25） U（见表3）。统计分析表明，0.1％添加组的酚氧化酶活性显著高于0.05％添加组和对照组。
摄食10 d后，0.05％添加组和0.1％添加组的杀菌活性为1：16血清稀释比例，而对照组为1：8血清稀释比例。
2.3 实验3——强化爱渔灵对哈维弧菌、白斑综合症病毒及黄头病毒感染后虾成活率的影响(见表4)
对各组虾肌肉注射2×105 CFU/ml 哈维弧菌后，0.05％添加组和0.1％添加组的成活率均为100％，而对照组仅有56.67％（见表4）。
各实验组虾感染白斑综合症病毒（WSSV）后的死亡率。对照组在感染第6 d的死亡率达到100％，而2个强化爱渔灵添加组的死亡率在第7 d才达到100％。
各处理组虾摄食实验饲料60 d后，黄头病毒攻毒实验的结果如下：对照组虾在第6 d死亡率即达到100％，而强化爱渔灵添加组的死亡率在第7 d才达100％。
4 讨论
本研究表明，以体重增长判定，饲料中添加0.1％强化爱渔灵可显著促进凡纳滨对虾的生长。这种促生长效果源于强化爱渔灵中含有27％ β－环糊精半胱胺盐酸盐。已有研究证实半胱胺可直接或间接增加哺乳动物和家禽体内生长激素的释放及生长率(Hall等，1986)。在大规格草鱼高密度养殖中，半胱胺已用于促进草鱼的生长(Xiao等，2003)。半胱胺和半胱胺盐酸盐在水产行业的应用具有很多优势：没有种属特异性、化学成分简单、口服方便、成本低廉 (Xiao等，2003)。
从强化爱渔灵对虾的免疫指标看，本研究结果表明，饲料中添加0.1％强化爱渔灵可在20 d后有效提高虾的总血细胞数以及吞噬百分率，而在第10 d后则可提高酚氧化酶活性以及杀菌活性。而饲料中添加0.05％强化爱渔灵则仅能提高总血细胞数和血清杀菌活性。关于半胱胺对水生动物的免疫促进功能尚未报道。但众所周知的是，半胱胺可特异性地消除哺乳动物体组织中生长抑素(抑制生长激素的释放),并可在体内或离体条件下诱导生长抑素细胞中生长抑素－14生物学和免疫学活性的可逆丧失(Hall等,1986;Xia等,2003)。更重要的是，强化爱渔灵中含有0.1％的维生素E，从而有效促进细胞的和体液的免疫功能(Reddy等，1987)。强化爱渔灵中的这两种活性成分有效促进了凡纳滨对虾的免疫功能。
本研究结果表明，在凡纳滨对虾饲料中添加0.1％强化爱渔灵饲喂40 d后，可有效促进虾的生长、成活率以及免疫功能（如总血细胞数、吞噬百分率、酚氧化酶活性以及杀菌活性）。
参考文献
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（编辑：徐世良，）
Chalor Limsuwan，曼谷农业大学水产系水产业研究中心。
Niti Chuchird、Phanwalai Jantarapan，单位及通讯地址同第一作者。
Watchariya Purivirojkul、谭青松，华中农业大学水产学院。
收稿日期：2009-03-30 |
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