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王红连 张凌裳 张东升 杜郭君 孙蔚榕 赵晓联 周群兰 谢 骏
摘 要 试验测定了杜仲叶主要提取物绿原酸对水产养殖中常见病原菌的最小抑菌浓度及其对嗜水气单胞菌体内和体外抑菌效果。结果显示，绿原酸对水产养殖中的常见病原菌嗜水气单胞菌最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)均为250 mg/l,哈维氏弧菌、苏伯利产气单胞菌的MIC与MBC均为500 mg/l，肠型点状产气单胞菌的MIC与MBC分别为500、1 000 mg/l。药敏试验结果发现，绿原酸对嗜水气单胞菌抑菌圈的直径为(19.4±1.2) mm，氟哌酸的抑菌圈直径为(30.3±1.3) mm,土霉素为(28.5±2.5) mm。攻毒试验结果显示,在攻毒7 d后，对照组死亡率为45％，饲料中添加0.5％绿原酸的试验组死亡率为10％，添加4%的试验组的死亡率为20％，添加1％和2％的试验组没有鱼死亡，表明饲料中添加1％的绿原酸能有效增强鱼体对嗜水气单胞菌的抵抗能力。试验结果说明，绿原酸对水产养殖中常见的病原菌具有良好的抑菌效果，对嗜水气单胞菌的抑菌效果与抗生素类抗菌药物相当，能够增强机体免疫力，对细菌性疾病具有较强的预防作用。
关键词 绿原酸；抑菌效果；药敏试验；攻毒试验
中图分类号 S963.73
随着我国水产养殖业的发展，各类危害水产养殖动物的病害也频频发生，而这些病害多由细菌引起。目前治疗细菌性疾病最常用的就是各类抗生素，但抗生素的滥用和误用，不仅容易使病原菌产生耐药性，还易产生残留，影响水产品的食物安全性。随着公众对食品安全越来越重视，寻求抗生素替代药品的需求就愈渐迫切。我国传统中药因其无残留、不易产生耐药性、能增强水产养殖动物免疫力而逐渐引起人们的重视，希望能从中药中提取到有效的活性成分，以取代部分高残留药物。
近年来，已经有许多研究者在中药的抗菌性方面做了大量利用研究[1-5]，但对于中药提取物对水产养殖中病原菌的抗菌作用的报道尚不多见[6-7]。本试验利用杜仲叶主要提取物绿原酸对水产养殖中常见病原菌嗜水气单胞菌体外和体内抑菌效果的研究，初步探讨了中药的抑菌性及增强机体免疫力的作用，为从中药中寻找抗生素的替代品提供一定的研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
试验所用细菌中嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，BSK－10)由浙江省淡水水产研究所提供，苏伯利产气单胞菌(Aeromonas sobria，CR79-1-1)、哈维氏弧菌（Vibrio Harveyi,E-12-10)和肠型点状产气单胞菌(Aeromonas puncta－ta intertinalis，58-20-9)均购自中国科学院水生生物研究所。
1.1.2 药材
杜仲叶取自江苏宜兴，均为当年夏季的新鲜叶。
1.2 方法
1.2.1 绿原酸的测定
按GB/T22250—2008 保健食品中绿原酸的测定进行[8]。
1.2.2 药液的制备
将杜仲叶粉碎，称取10 g样品，加入100 ml去离子水(pH值为4)预浸泡过夜后，超声波处理30 min,过滤,滤渣用100 ml去离子水重复提取1次,超声波处理30 min,合并2次提取液,减压浓缩至100 ml左右,浓缩液中加入1%壳聚糖溶液4 ml絮凝,搅拌,60 ℃避光静止60 min，过滤，滤液用活性炭脱色（添加量为1%）（pH值为4），后经大孔径树脂过柱得绿原酸类物质。浓缩至1 ml提取液中含2.0 g生药。
1.2.3 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定
用接种环沾取纯化的试验菌株，接种到肉汁蛋白胨的液体培养基上，28 ℃培养18 h后，将菌液稀释到2×106 CFU/ml。试验管碟法[9],药物用无菌水适当稀释,再在试管中用无菌营养肉汤倍比稀释,使药物浓度呈2倍递减共10个梯度(药物浓度由1：2到1：1 024),最后一管不加药物作对照，重复3次。分别向各试管中接种稀释好的供试菌悬液20 μl，置27～30 ℃培养24 h，肉眼观察，以不显示浊度，细菌未生长的那一管的药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。取未见到细菌生长试管的0.05 ml肉汤划线接种营养琼脂平板上培养24 h后，平板上无菌落或者菌落生长数≤10的药物浓度为最低杀菌浓度(MBC)。
1.2.4 纸片药敏试验
将直径为6 mm的纸片在杜仲叶提取物绿原酸中浸泡4 h，制成绿原酸的滤纸片。取浓度为1.5×106 CFU/ml的嗜水气单胞菌100 μl涂布在培养皿上，然后将浸泡过浓度均为1 g/l的绿原酸、氟哌酸和土霉素的药敏纸片分别贴在培养皿上，每个药物分别做3个平行。培养24 h后测定抑菌圈大小。抑菌环直径≥20 mm为极敏，15~20 mm为高敏，10~15 mm为中敏，≤10 mm为低敏[10]。
1.2.5 攻毒试验
预防性给药，试验鱼为取自中国水产科学院淡水渔业研究中心苗种基地的鲫鱼，饵料中分别添加0.5％、1％、2％和4％的杜仲叶提取物绿原酸饲喂，大塘中饲养56 d后，在实验室装有200 L水的玻璃缸(长×宽×高为100 cm×45 cm×75 cm)中暂养7 d后开始试验。
将嗜水气单胞菌接种于普通肉汤培养液中，27～30 ℃培养20～24 h得到细菌悬液。测定细菌浓度后，将菌液稀释至4×106 CFU/ml。每100 g鱼体重注射1 ml菌液，注射感染后即放入上述玻璃缸中。试验为期10 d，试验期间水温28～30 ℃，pH值7.2～7.8。
试验分别设置注射感染给药(给药量分别为0.5％、1％、2％和4％)、不给药注射嗜水气单胞菌对照组以及不给药不注射嗜水气单胞菌阴性对照组，每个试验组各放养鲫鱼鱼20条。观察1周，统计各试验组的死亡率。
2 结果与分析
2.1 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定（见表1）
表1结果显示，杜仲叶主要提取物绿原酸对嗜水气单胞菌MIC与MBC均为250 mg/l,苏伯利产气单胞菌、哈维氏菌的MIC与MBC均为500 mg/l，肠型点状产气单胞菌的MIC与MBC分别为500、1 000 mg/l，说明绿原酸对水产养殖中常见病原菌具有良好的抑菌效果。
2.2 纸片药敏试验
药敏试验显示,绿原酸对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为19.3 mm,氟哌酸为30.3 mm,土霉素为28.5 mm,表明该提取物对嗜水气单胞菌的抑菌效果可与抗生素类抗菌药物相比拟，具有较强的抑菌作用。
2.3 攻毒试验（见表2）
注射嗜水气单胞菌2 h后，部分试验鱼体色开始变黑，之后陆续有鱼死亡，死鱼呈典型的淡水养殖鱼类出血性败血症症状：鳍基部、眼眶出血，内脏、肠红肿。第7 d起，试验鱼停止死亡。
试验鱼阳性对照组死亡率为45.00％，给药浓度为0.5％的试验I组死亡率为10.0％，给药浓度为4％的试验Ⅳ组的死亡率为20％，给药浓度为1％和2％的试验Ⅱ组和Ⅲ组没有鱼死亡，说明该中药提取物对细菌性疾病具有较强的预防作用。
3 讨论
杜仲叶主要提取物绿原酸对水产养殖过程中不同病原菌的抑菌浓度不同，说明不同的病原菌对药物具有不同的抗药性。从试验结果可以看出，绿原酸对嗜水气单胞菌的抑菌效果最佳，因此，选用嗜水气单胞菌进行下一步试验。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)隶属于气单胞菌科(Aermonadaceae)、气单胞菌属(Aero-mortot8),为人、畜及水生动物共患的条件致病菌，广泛存在于水环境中，是多种水产动物的主要致病菌。通过纸片药敏试验发现，绿原酸对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径可达19.4 mm左右。王宏军[11]等研究发现，金银花中绿原酸对乳房炎主要致病菌的抑菌圈直径均在10 mm以上，可能是因为本试验所用的绿原酸是浓缩后的提取物，其有效成分含量比较高。此外，张泽生[12]等研究发现，金银花中绿原酸对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果与庆大霉素相似，对大肠杆菌和藤黄八叠球菌的抑菌效果甚至超过了庆大霉素。本试验亦显示杜仲叶主要提取物绿原酸的抑菌圈大小为氟哌酸的64.3％，为土霉素的68.7％，与氟哌酸、土霉素的抑菌效果接近，说明绿原酸对嗜水气单胞菌的抑菌作用可以与抗生素类药物相比拟。
国内外学者普遍认为，嗜水气单胞菌的致病因子主要有外毒素、胞外蛋白酶和膜上粘附因子等[13-18]。本试验发现，在饲料内添加适量的杜仲叶主要提取物绿原酸能提高鱼体对嗜水气单胞菌的抵抗力，可能是因为绿原酸类物质除了能提高机体免疫力以外，还能对外毒素、胞外蛋白酶的分泌产生影响。李爱华[19]等研究发现，鲫鱼腹腔注射中药的水溶性提取物后，可以提高鲫鱼对嗜水气单胞菌感染的抗性，体内和体外试验都显示该水溶性提取物具有显著的激活补体代偿途径活性作用。试验中还发现，当饲料中绿原酸的添加量达到4％时，鱼体对嗜水气单胞菌的抵抗能力反而下降。这可能是由于添加浓度过高后对机体的免疫力产生一定的影响，导致免疫抵抗力下降，或可能由高浓度的绿原酸对鱼体细胞产生一定的毒副作用。从试验结果来看，在饲料中添加1％的绿原酸，能够增强鱼体对细菌性疾病的抵抗能力。
本试验结果显示，杜仲叶主要提取物绿原酸对水产养殖中常见的病原菌具有良好的抑菌效果，对嗜水气单胞菌的抑菌效果可与抗生素类抗菌药物比拟，能够增强机体免疫力，对细菌性疾病具有较强的预防作用，为利用传统中药治疗各类水生动物疾病提供了研究基础。
参考文献
[1] 路振香,谢文科.八味中药提取物的体外抑菌试验[J].中国兽医医药杂志,2005(3):37-39.
[2] 陈仕江,丁伟,杨帮,等.10种中药植物杀菌活性研究[J].重庆中草药研究,2004,50(2):1-4,15.
[3] 马保臣,李建基,刘翠艳.17种中药对奶牛乳腺炎4种病原菌的抑菌试验[J].中国兽医杂志,2003,39(7):28-29.
[4] 石达友,刘汉儒,卓曲,等.中药提取物对鸡免疫器官发育和新城疫抗体水平的影响[J].中国兽医杂志,2004(2):4.
[5] 韩剑众,胡永金,田允波,等.中药有效成分抽提物体外抑菌试验及对仔猪生长和肠道微生物区系的影响[J].云南农业大学学报,2002, 17(1)56-58.
[6] 周群兰, 郑小平, 刘波, 等. 大黄提取物对嗜水气单胞菌的抑菌效果[J].江苏农业科学,2007(2):64-66.
[7] 叶元土,陈昌齐,朱文介,等.八种中药对鲤烂鳃病原菌抑菌作用研究[J].水产科学,1994,13(6):14-17.
[8] GB/T22250—2008.保健食品中绿原酸的测定[S].中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.2008.
[9] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1996.
[10] 戴自英.临床抗菌药物学[M].北京:人民卫生出版社,1985,219-223.
[11] 王宏军,吴国娟,李焕荣,等.金银花中绿原酸提取方法的筛选及其抑菌作用[J].北京农学院学报,2003,18(4):262-265.
[12] 张泽生,乌兰.金银花中绿原酸的体外抑菌和抗氧化性的研究[J].天津科技大学学报,2005,20(2):5-8.
[13] Buchley J T, Howerd S P. The cytotoxic enterotoxin of Aeromonas hydrophila is aerolysin[J]. Infect. and Immun., 1999, 67(1):466-467.
[14] Christopher Y W F, Michael W H, Robert L P F. Inactivation of two haemolytic toxin genes in Aeromonas hydrophil attenuates virulence in a suckling mouse mode[J]. Microbiology, 1998,144:291-298.
[15] 储卫华,陆承平.嗜水气单胞菌外蛋白酶对鲫鱼的致病性[J].南京农业大学学报,2000,23(2):80-84.
[16] Rivero O, Anguita J, Mateos D. Cloning and chatacterization of an temperature-labile serine extracellular protease gene from Aeromonas hydrophil[J]. FEMS Microbiology Letters, 1991，81:1-8.
[17] 涂小林,陆承平.嗜水气单胞菌HEC毒素提取、纯化及其特性分析[J]. 微生物学报,1993,32(6):432-438.
[18] Chang T M, Liu C C, Chang M C. Cloning and sequence analysis of the gene(epral)encoding an extracellular protease[J].Gene,1997, 199:225-229.
[19] 李爱华,王文博,蔡桃珍,等.一种中药对鲫鱼免疫功能的促进作用[J].鱼类病害研究,2001(3):84.
（编辑：徐世良，）
王红连，中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，214081，江苏无锡。
张凌裳、张东升、周群兰、谢骏（通讯作者），单位及通讯地址同第一作者。
杜郭君、孙蔚榕、赵晓联，江苏省苏微微生物研究有限公司。
收稿日期：2009-04-20
★ 农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室开放基金项目“天然植物源活性物质——绿原酸的提取工艺研究”(BZ2007-11)
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