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雷冬至 金曙光 乌仁塔娜
摘 要 以3头安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为供体动物，应用体外批次培养法，利用多项指标综合指数(MFAEI)，通过测定pH值、72 h的累积产气量、有机物质降解率、微生物蛋白（MCP）及挥发性脂肪酸（VFA）产量，研究了粗-精料间的组合效应。试验结果表明，在不同粗料混合以后与同一精料(55：45)搭配产生了明显的正组合效应。当羊草、玉米青贮、草木樨分别以50%的比例替代玉米秸秆时，相对于100%的玉米秸秆来说，以玉米秸+草木樨+精料(27.5：27.5：45)组(MFAEI：1.199)和玉米秸+羊草+精料(27.5：27.5：45)组(MFAEI：1.032)这两组组合效应值较大，而玉米秸+玉米青贮+精料(27.5：27.5：45)组组合效应值(MFAEI：0.997)较小。以玉米秸+草木樨+精料组混合日粮多项组合效应值最高，组合效应最好。说明粗饲料组合后通过营养素间的互补，提高了日粮的整体发酵水平。
关键词 粗饲料组合效应；体外产气法；综合指数
中图分类号 S816.31
在反刍动物日粮中，粗饲料通常占40%～80%，是瘤胃微生物和宿主动物重要营养来源。粗饲料品质对反刍动物生产性能和健康有极大的影响，并直接影响精补料的给量与成本，最终影响到经济效益。正确使用粗饲料是提供反刍家畜平衡日粮的基础。美国Wisconsin大学研究了不同质量的紫花苜蓿干草对奶牛产奶量的影响。结果显示：精料不变的情况下，奶牛产奶量随牧草质量的提高而提高；高质量的苜蓿干草，即使配合少量的精料，产奶量也能达到较高水平。
卢德勋（2001）提出的粗饲料分级指数（GI）优化日粮配合的依据就是粗饲料间存在着组合效应，以GI为指标，将不同类型、品种及品质的粗饲料进行组合和搭配，来最大限度地发挥粗饲料间的正组合效应，控制和消除粗饲料间的负组合效应，从而最大限度地发挥动物的生产性能，节约精料用量，大大降低饲养成本。王旭（2003）采用体外法研究了粗饲料混合后的组合效应，并首次用多项指标综合指数（MFAEI）（卢德勋，2003）对瘤胃发酵产物进行了全面、综合的评价。本试验采用体外法，利用多项指标综合指数（MFAEI）通过分析72 h培养液中pH值、累积产气量、有机物质降解率、微生物蛋白（MCP）及挥发性脂肪酸（VFA）产量，对不同粗料玉米秸秆、羊草、玉米青贮和草木樨与同一精料搭配的组合效应进行综合评定。
1 材料与方法
1.1 试验材料
体外批次培养用玉米秸秆、羊草、玉米青贮和草木樨均采自内蒙古呼伦贝尔市，制成风干样品后粉碎过40目筛，备用。
1.2 试验动物及日粮
选择3头体况良好，体重相近，安装永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛，供采集瘤胃液用。试验牛栓系饲养，每日6：00和18：00两次饲喂，自由饮水，常规光照,驱虫,专人管理。试验日粮组成及营养水平见表1。
1.3 试验设计
本试验采用体外法，利用多项指标综合指数（MFAEI），通过分析72 h培养液中的有关指标，以试验用瘤胃液供体牛日粮配方为对照，羊草、玉米青贮、草木樨分别取代对照组日粮中50%的玉米秸秆饲料，即组合1为对照、组合2加青贮、组合3加羊草、组合4加草木樨（见表2），利用体外发酵装置对上述各组合日粮样本作多批次、多时间点、多项指标综合评定和筛选。进行体外3、6、12、24、48、72 h培养。
1.4 体外培养试验操作
本试验每个测定样品量为1.0 g，培养液由40 ml缓冲液与20 ml瘤胃液组成，在72 h内多时间点(培养的第3、6、12、24、48、72 h)、多批次采样，每个样品设3个重复。连续记录72 h产气量，并选用了体外培养72 h内6个时间点测定了该时间点的pH值、有机物质降解率、微生物蛋白（MCP）及挥发性脂肪酸（VFA）产量进行分析计算，从而研究粗饲料间的组合效应。
1.5 产气装置设计
1.5.1 装置
主体为澳大利亚生产的恒温水浴摇床，水浴温度和振荡频率可调；用玻璃瓶(容积为200 ml)作培养瓶，瓶口安装带塑料管的橡皮塞；同时，塑料管带有可打开和关闭的塑料三通阀以保证厌氧环境；塑料三通与医用玻璃注射器（可计量容积为30 ml）相连。注射器每次使用之前洗净晾干，然后用少量液体石蜡涂在活塞筒的四周，以防漏气，减少气体产生过程中活塞向上移动的阻力。
1.5.2 缓冲液配制
缓冲试剂和常量元素溶液——A液:称取K2HPO4 382 mg,KH2PO4 292 mg,(NH4)2SO4 480 mg,NaCl 200 mg,MgSO4·7H2O 100 mg和Na2CO3 4 000 mg。将上述试剂混合后加入蒸馏水定容至1 000 ml。该溶液在使用前一天配制待用。
微量元素溶液——B液：准确称取EDTA 500 mg,FeSO4·7H2O 200 mg，MnCl2·4H2O 200 mg，ZnSO4·7H2O 10 mg，H3BO3 30 mg，CoCl2·6H2O 20 mg，CuCl2·2H2O 1 mg，NiCl2·6H2O 2 mg和NaMoO4 3 mg。将上述试剂混合后加蒸馏水定容至1 000 ml。持续通入CO2 18 h后，盖严瓶口，置于冰箱备用。
还原剂溶液——C液:称取25 g Na2S·9H2O置于100 ml容量瓶中，加80 ml蒸馏水溶解，定容至100 ml,持续充入CO2 20 min后，盖严瓶口，置于冰箱备用。
缓冲液制备:准确量取790.4 ml A液,8 ml B液,经充分混和后持续通入CO2 18 h,并于培养前1 h加入1.6 ml C液,充分混合,然后将其分装于已加入1.0 g底物的培养瓶内（每个培养瓶加40 ml）,持续通入CO2气体10 min，盖上安装有塑料三通的橡皮塞，置于恒温水浴中预热至39 ℃待用。
1.5.3 瘤胃液的采集和培养液的配制
晨饲（06：00）后2 h由3头体况良好、体重相近的安装永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛瘤胃内上下左右不同位点采集足量瘤胃液，灌入经预热达39 ℃并通有CO2的保温瓶中，灌满后立即盖严瓶口，迅速返回试验室，经200目尼龙布过滤后持续通入CO2气体5 min，然后迅速分装至上述已预热好并通有CO2的培养瓶内（每个培养瓶加20 ml瘤胃液）。接通培养瓶和注射器，打开振荡开关，开始培养。
1.6 测定指标和分析方法
测定培养后不同时间点的产气量、pH值、有机物质降解率、菌体蛋白产量、VFA产量。
1.6.1 样品预处理
各时间点培养结束后，取出培养瓶，测定培养液pH值，然后无损失地转移至100 ml大离心管中，在4 000 r/min离心15 min，去除原虫和饲料大颗粒。
1.6.2 有机物质降解率的测定
离心后沉淀转入150 ml大坩埚中，在105℃下烘干至恒重以测定其干物质（DM）含量，然后转入马福炉中550～600 ℃下烘至恒重，测定粗灰分，测定有机物质降解率。
1.6.3 菌体蛋白质测定
菌体蛋白质分离采用差速离心法。参照Cotta等（1982）和Broderick等（1989）阐述的方法。
1.6.4 pH值测定
采用25型酸度计测定（上海雷磁分析仪器厂，玻璃电极）。
1.6.5 挥发性脂肪酸（VFA）测定
用日本岛津GC-7A气相色谱仪依内标法进行测定。
1.7 数据处理
试验数据用Excel进行处理后采用SAS9.0软件，ANOVA平衡设计方差分析。
2 结果（见表3）与讨论
2.1 pH值
体外消化条件下，瘤胃pH值的波动反映瘤胃的综合发酵水平，它受日粮性质、积聚的有机酸和唾液分泌量的影响。pH值越低，发酵过程中产酸量越多，与产酸量相对应，则微生物越多。
从表3可以看出，组合4的72 h pH值下降幅度低于其它各组，其pH值最高,其它组的pH值差异不显著（P＞0.05）。组合2与组合3的pH值下降幅度较大，趋势基本一致。组合1的pH值下降幅度最大。当瘤胃内pH值均高于或接近6.5，利于纤维物质的消化；大量实验证明，当瘤胃内pH值低于6.2时，纤维素的消化将受到抑制。仅从该指标看，组合4相对其它各组能很好的维持微生物对纤维素的消化。
2.2 72 h累积产气量
瘤胃中的产气主要包括二氧化碳和甲烷两种气体，其中二氧化碳气体占70%左右,甲烷气体占20%左右，产气量是一个综合反映饲料可发酵程度的指标,表现了瘤胃微生物活动的总体趋势，是反映饲料蛋白价值的综合指标。饲料的可发酵性越强，瘤胃微生物的活性越高,产气量就越大，饲料中的可发酵有机物含量越少,瘤胃微生物的活性越弱，产气量也相应越少。
从表3可以看出,随着时间的不断增加,各组合体外发酵累积产气量均呈上升的趋势,产气量在3～24 h有一个快速发酵的过程,产气量急剧上升,48 h以后产气幅度有所减缓。组合4的72 h累积产气量最高，显著（P＜0.05）高于其它各组，组合效应最明显。组合1的累积产气量最低。
2.3 有机物质降解率
饲料有机物质降解率代表着该饲料被微生物转化的能力，降解率越高说明瘤胃的发酵效果越好，瘤胃微生物的活性越强。
从表3看出，组合4的48 h和72 h有机物质降解率显著（P＜0.05）高于其它组，其它组的排序为组合3＞组合2＞组合1。组合3和组合2的组间差异不显著（P＞0.05），其它组合的有机物质降解率都显著高于（P＜0.05）组合1。
2.4 微生物蛋白(MCP)产量
微生物菌体蛋白是反刍动物最主要的氮源供应者，能提供蛋白需要的40%～80％，其合成需要各种营养物质的供应，包括碳水化合物、维生素、微量元素及常量元素等。而维持微生物生长最主要的营养物质是能量和蛋白质。MCP浓度间接地反映培养体系中微生物种群的数量；MCP浓度大小反映了微生物利用NH3-N的能力。
由表3可以看出，组合4的72 h MCP明显高于其它各组,差异显著（P<0.05），组合2与组合3的组间差异不显著（P＞0.05），但高于组合1且差异显著（P<0.05）。说明组合4微生物利用氨的能力最强，组合1微生物利用氨的能力最差。
2.5 VFA产量
瘤胃碳水化合物发酵的主要产物是乙酸、丙酸和丁酸等VFA，它们是反刍动物主要的能量来源及合成乳脂和体脂的原料。VFA浓度在很大程度上影响瘤胃pH值，而反过来瘤胃pH值对瘤胃微生物群落也有重要影响。因此VFA的产量及其比例可显著影响反刍动物对营养物质的吸收、利用和生产能力的发挥。
由表3可以看出，随体外培养时间的延长，总VFA的产量逐渐升高。在体外培养时，组合2、3、4在24 h时VFA产量有所降低，24 h后开始回升。72 h培养结束时组合4的VFA产量明显高于其它组合，差异显著（P<0.05），其次为组合3＞组合1＞组合2。
2.6 组合效应值
综上所述，对于瘤胃发酵效率的5个指标，组合3和组合4在多数时间点的数值高于其它两个组合，但是个别时间点的数值也有一些波动。为了能够更加客观地反应发酵效果，卢德勋(2004)提出了利用多项指标综合效应值进行评定的方法及计算公式。将上述4项指标的数据代入该公式进行计算,其结果见表4。
表4所显各项组合效应中，组合4各项目的组合效应值都表现最高，组合3次高，组合2也表现出正的组合效应。说明用草木樨、羊草、青贮代替部分玉米秸秆取得较好的效果。
3 结论
利用体外发酵法对4种组合日粮样本作多批次、多时间点、多项指标综合评定，经全面分析比较，本试验的4种粗料组合日粮多项组合效应值由高到低依次为:组合4>组合3>组合2>组合1。本试验在玉米秸秆中搭配草木樨、羊草、青贮，观察到了明显的正组合效应，从而证实粗饲料组合以后，通过营养素间的互补，可提高组合粗饲料的整体发酵水平。同时也可看出添加草木樨、羊草等优质牧草显著提高了包括低质粗饲料在内的混合粗饲料的整体发酵水平，进而提高家畜的生产性能是可行的。
参考文献
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[2] Broderick G A, W. M. Craig. Metabolism of peptides and amino acids during in vitro protein degradation by mixed rumen organisms[J]. J. Dairy Sci., 1989,72:2540-2548.
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（编辑：张学智，）
雷冬至，内蒙古农业大学动物科学与医学学院，010018，内蒙古呼和浩特市昭乌达路306号。
金曙光(通讯作者)、乌仁塔娜,单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2008-11-17
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