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王雅倩 赵国琦 闫韩韩 俞 路
摘 要 试验通过体外培养法研究日粮中添加苜蓿皂苷对山羊瘤胃微生物发酵功能的影响。试验分5组，各组苜蓿皂苷的添加水平分别为基础底物（2 g）的0（对照组）、1%、2%、3%及4%，每组3个重复，体外厌氧培养24 h，并分别测定各处理组pH值和挥发性脂肪酸含量。结果表明：添加苜蓿皂苷未对培养液pH值产生显著影响；添加1%~4%的苜蓿皂苷可极显著提高培养液中乙酸、丙酸浓度（P<0.01）；添加1%的苜蓿皂苷可极显著提高丁酸浓度（P<0.01），2%组可显著提高丁酸浓度（P<0.05）；各苜蓿皂苷添加组中乙酸/丙酸的比例均极显著低于对照组（P<0.01）。结论：本试验条件下，添加1%~4%的苜蓿皂苷可改善瘤胃发酵模式，提高反刍动物对发酵终产物的利用率，且添加1%的苜蓿皂苷效果最佳。
关键词 苜蓿皂苷；pH值；挥发性脂肪酸；体外法
中图分类号 S816.79
通过瘤胃途径调控反刍动物生长是动物营养的研究重点。长期以来，国内外学者对反刍动物瘤胃的调控进行了大量研究，研制出许多可以用于改善瘤胃发酵的化学药物，但此类药物易使动物产生抗药性，且导致药物残留，危害人类健康。因此，天然植物提取物的开发和应用备受关注。
苜蓿皂苷是一种理想的绿色植物添加剂，其是从苜蓿中提取的特有生物活性物质，由糖或非糖类化合物中的羟基脱水缩合而成。在单胃动物中苜蓿皂苷生物活性的研究报道较多，如溶血作用、抑制生长、降低胆固醇及对酶的非特异性抑制作用等(刘凯等,1999)[1],但苜蓿皂苷在反刍动物中的应用研究较少，近年来有报道称皂苷可改变瘤胃微生物的种类和数量，进而影响瘤胃发酵[2]。本试验拟用体外批次培养方法，研究不同水平的苜蓿皂苷对生长山羊瘤胃发酵功能的影响，以期筛选出适宜的添加量，为体内试验及进一步的深入研究奠定基础，并为苜蓿皂苷在反刍动物日粮中的应用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验设计
试验在扬州大学动物科学与技术学院实验牧场进行。分5个处理组，每个处理设3个重复，每重复1个发酵瓶,每瓶加入2 g试验饲料做为底物，各处理分别在底物基础上添加0(对照组)、1%、2%、3%和4%的苜蓿皂苷。试验开始当日各发酵瓶分别添加80 ml人工唾液和40 ml瘤胃液,与底物及皂苷混合均匀后立即置于39 ℃恒温水浴摇床中,并通入CO2进行24 h厌氧培养。
1.2 体外培养装置
体外发酵装置由恒温水浴摇床、发酵瓶和CO2钢瓶组成。发酵瓶进样口用橡皮塞密闭，设有两个通路，一个进行气体交换，一个供应CO2。
1.3 试验材料
试验用苜蓿皂苷购于西安天一生物技术有限公司，为砖红色粉末，属五环三萜类皂苷，其主要活性成分是三萜皂苷。
1.4 底物组成
底物即试验饲料，参照NRC（2001）[3]山羊营养需要配制，具体成分含量和营养水平见表1。
1.5 瘤胃液的采集
瘤胃液采自4只22月龄，体重（25±2.0） kg，健康状况良好，体况相近并均安装有永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊。试验羊均采用代谢架饲养，单只单架，饲喂上述试验饲料，每日于8：00和18：00等量饲喂，自由饮水，并按常规程序驱虫。
试验当日，于4只徐淮山羊瘤胃内上下左右不同位点采集足量瘤胃液，灌入已预热至39 ℃并充有CO2的保温瓶中，灌满后立即盖严瓶口，迅速返回实验室，经4层纱布过滤后持续通入CO2气体5 min，然后迅速分装至经同样预热、充气处理的发酵瓶内[4]。
1.6 人工唾液的配制
人工唾液配制参照Menke等（1988）的方法[5],pH值为7.1±0.15，具体配方为：1 000 ml人工唾液中含有缓冲液237 ml、常量矿物盐溶液237 ml、微量矿物盐溶液0.12 ml,另加葡萄糖10 g、（15NH4）2SO4 0.503 2 g,其余为蒸馏水。其中缓冲液（pH值为8.1）组成为每1 000 ml蒸馏水中含NaHCO3 35.00 g、NH4HCO3 4.00 g;常量矿物盐溶液(pH值为6.8)组成为每1 000 ml蒸馏水中含KH2PO4 6.20 g、Na2HPO4 5.70 g、NaCl 2.22 g、MgSO4·7H2O 0.60 g;微量矿物盐溶液组成为每1 000 ml蒸馏水中含MnCl2 10.00 g、CaCl2 13.20 g、CoCl2·6H2O 1.00 g、FeCl3·6H2O 0.80 g。
1.7 样品的采集及测定
分别于0、2、4、6、8、10、12和24 h 8个时间点测定各发酵瓶中pH值，并采集5 ml发酵液立即置于 -20 ℃冰箱密封保存备测挥发性脂肪酸（VFA）。
采用pHS-3C型pH计于采样后立即测定培养液pH值；VFA主要包括乙酸、丙酸、丁酸，使用日本岛津GC-14B型气相色谱仪以内标法（内标物为巴豆酸）进行测定，并计算乙酸/丙酸的比例[3]。
1.8 数据处理
试验数据采用Excel 2007软件进行记录整理，以SPSS 13.0统计软件的ANOVA模块进行方差分析，并采用Duncan's法分别在0.05和0.01水平进行差异显著性比较，试验结果以平均数±标准误表示。
2 结果与分析
2.1 苜蓿皂苷对pH值的动态影响（见表2）
由表2可见，各组混合培养液中pH值变化规律相一致，均呈现随时间延长而下降的趋势。4个苜蓿皂苷添加组各时间点pH值均有不同程度降低，且降幅有随添加量增加而加大的趋势。皂苷添加组与对照组相比pH平均值均差异不显著。
2.2 苜蓿皂苷对乙酸浓度的动态影响（见表3）
由表3可知，2 h时各苜蓿皂苷添加组乙酸浓度均显著高于对照组（P<0.05），且4%组最高；4 h时1%组乙酸浓度极显著高于对照组(P<0.01),2%组和3%组无显著变化，4%组则显著降低（P<0.05）；8 h时1%组乙酸浓度最高,其后依次是2%组、4%组和3%组,较对照组分别提高18.43%(P<0.01)、9.20%(P<0.01)、6.54%(P<0.01)、5.36%(P<0.05);24 h时各皂苷添加组乙酸浓度与对照组相比,均有不同程度升高，且3%组和4%组增幅达到极显著水平(P<0.01)。与对照组相比,添加苜蓿皂苷的各组培养液中乙酸浓度平均值极显著高于对照组(P<0.01);其中以1%组含量最高。
2.3 苜蓿皂苷对丙酸浓度的动态影响（见表4）
从表4的结果可见,2 h时1%组丙酸浓度显著高于对照组(P<0.05),其余各处理组与对照组差异不显著(P>0.05)；4 h时1%组和2%组丙酸浓度均极显著高于其它各组(P<0.01),且1%组极显著高于2％组(P<0.01),其余各组间差异不显著(P>0.05);6 h时2%组丙酸浓度极显著高于对照组(P<0.01),显著高于4％组(P<0.05),其余各组间差异不显著（P>0.05）；8 h时1%组丙酸浓度最高,而后依次为2%组、4%组、3%组，且各添加组丙酸浓度极显著高于对照组(P<0.01)。24 h时各皂苷添加组丙酸浓度均极显著高于对照组(P<0.01)。从平均值来看，1%组丙酸浓度平均值最高,而后依次是2%组、3%组、4%组,较对照组分别提高24.91%、18.70%、13.99%和13.61%,增幅均达到极显著水平(P<0.01)。
2.4 苜蓿皂苷对丁酸浓度的动态影响（见表5）
由表5可知，4 h时苜蓿皂苷添加组的丁酸浓度均高于对照组,但只有1%组达显著水平(P<0.05)；6 h时1%组显著高于对照组(P<0.05)，2%组和3%组丁酸浓度极显著高于对照组(P<0.01)；8 h和10 h时1%组丁酸浓度均极显著高于对照组(P<0.01),而2%组于8 h时比对照组显著增加（P<0.05）；24 h时各添加组丁酸浓度均比对照组有所增加，但只有2%组达显著水平（P<0.05）。添加苜蓿皂苷的各组培养液中丁酸浓度平均值均高于对照组，其中1%组比对照组提高33.54%（P<0.01），2%组高于对照组25.32%（P<0.05），其余各组间无显著差异（P>0.05）。
2.5 苜蓿皂苷对乙酸/丙酸比例的动态影响（见表6）
由表6可以看出，除0 h和2 h外，其它各时间点4个皂苷添加组乙酸/丙酸比例较对照组均有不同程度降低，且除6 h外均以1%组降幅为最大。1%～4%组乙酸/丙酸比例的平均值分别低于对照组14.52%、9.32%、6.03%和6.85%,且均达到极显著水平(P<0.01)。
3 讨论
3.1 苜蓿皂苷对培养液pH值的动态影响
pH值的波动主要受日粮性质、有机酸积聚和唾液分泌量等因素影响，其可反映瘤胃的综合发酵水平[6]。本试验中采用体外批次培养法，无底物外流、挥发性脂肪酸的吸收以及唾液的缓冲作用，以致发酵产物大量累积，故pH值呈现不断下降趋势[6]。当pH值低于5.5时，瘤胃微生物蛋白合成的效率会受到影响[7]。本试验中各皂苷添加组不同时间点pH值虽低于对照组，但均高于5.5，提示添加苜蓿皂苷未对瘤胃发酵产生不利影响。胡伟莲（2005）报道，体外培养条件下，添加茶皂苷后混合培养液pH值均有所降低，但尚属正常范围之内[8]，这与本试验结果有一致性。
3.2 苜蓿皂苷对培养液VFA的动态影响
瘤胃发酵产生的VFA是反刍动物重要的能量来源,约占反刍动物能量吸收总量的70%～80%,评定VFA产量及比例,对进一步提高反刍动物能量利用率具有重要意义[8]。而乙酸、丙酸、丁酸约占瘤胃发酵VFA总产量的95%,因此,其对瘤胃发酵效率具重要意义。从本试验结果可以看出,添加苜蓿皂苷对山羊瘤胃培养液发酵可产生影响,1%～4%组均提高了乙酸、丙酸和丁酸浓度,这与Klita(1996)添加苜蓿根皂苷提高乙酸、丙酸和丁酸浓度的报道相一致[9]。此外添加菝葜苷、田菁属皂苷也有类似的报道[10-11]。
由于瘤胃发酵类型明显地影响着能量利用率和能量储备部位，而丙酸则是反刍动物重要的葡萄糖前体，可提供合成葡萄糖所需原料的80%～90%，因此丙酸型发酵能为机体提供更多的能量。瘤胃VFA中丙酸的绝对含量及其所占VFA的比例对于体内葡萄糖的合成具有很大的影响。反刍动物在以低质粗饲料为主的饲喂状态下，瘤胃碳水化合物发酵产生的丙酸比例少，常引起体内葡萄糖的不足。在这种状态下，提高瘤胃VFA中丙酸的比例和产量尤为重要。VFA的能量转化效率与VFA的组成比例有重要关系[12]。本试验中,添加苜蓿皂苷各处理组中丙酸浓度极显著提高,乙酸/丙酸的比例均呈现下降趋势，改变了发酵模式,提高了反刍动物对发酵终产物的利用率[13]。这与Lu等(1987)、Wina等（2005）的报道相一致[14-15]。
4 结论
本试验条件下，在1%～4%的范围内添加苜蓿皂苷可改善瘤胃发酵，提高反刍动物对发酵终产物的利用率，且1%组效果最佳。
参考文献
[1] 魏晓玲. 苜蓿总皂苷粗提物的提取工艺及其对绵羊瘤胃发酵功能的影响[D]. 内蒙古农业大学, 2007:39.
[2] Wang Y, McAllister T A, Yanke L J, et al.Effect of steroidal saponin from Yucca schidigera extract on ruminal microbes [J]. Journal of Applied Microbiology, 2000, 88: 887-896.
[3] NRC. Nutrient requirements of dairy cattle (10th ed) [M]. Washing D C: National Academy Press, 2001.
[4] 凌宝明,瞿明仁,卢德勋,等.利用体外法研究功能性寡糖对生长绵羊瘤胃发酵特性的影响[J]. 动物营养学报, 2007,19(2):129-134.
[5] Menke K H, Steingass H. Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fliud [J]. Animal Reserch and Develop, 1988(28): 7-55.
[6] 匡伟,郭玉华,尹召华,等. 利用体外法研究不同水平维生素A对奶牛瘤胃内环境参数的影响[J]. 动物营养学报,2006,18(3): 197-202.
[7] Calsamiglia S, Ferret A, Devant M. Effects of pH and pH fluctuations on microbial fermentation and nutrient flow from a dual-flow continuous culture system [J]. Journal of Dairy Science, 2002, 85: 574-579.
[8] 胡伟莲. 皂甙对瘤胃发酵与甲烷产量及动物生产性能影响的研究[D]. 浙江大学, 2005: 63.
[9] Klita P T, Mathison G W, Fenton T W, et al. Effects of alfalfa root saponins on digestive function in sheep[J]. Journal of Animal Science, 1996, 74:1144-1156.
[10] Lila Z A, Mohammed N, Kanda S, et al. Effect of sarsaponin on rumen fermentation with particular reference to methane production in Vitro[J]. Journal of Dairy Science, 2003, 86: 3330-3336.
[11] Newbold C J, El Hassan S M, Wang J M, et al. Influence of foliage from African multipurpose trees on activity of rumen protozoa and bacteria[J].British Journal of Nutrition,1997,78: 237-249.
[12] 王桂瑛, 毛华明, 文际坤. 玉米不同加工处理对瘤胃液VFA浓度的影响[J]. 饲料工业, 2008, 29(1): 44-46.
[13] Kreuzer M, Kirchgessner M, Muller H L. Effect of defaunation on the loss energy in wethers fed different quantitites of cellulose and normal or steamflaked maize starch [J]. Animal Feed Science and Technology, 1986, 16: 233-241.
[14] Lu C D, Tsai L S, Schaefer D M, et al. Alteration of Fermentation in Continuous Culture of Mixed Rumen Bacteria by Isolated Alfalfa Saponins [J].Journal of Dairy Science,1987,70:4799-4805.
[15] Wina E, Muetzel S, Becker K. The impact of saponins or saponin-containing plant materials on ruminant production-A Review [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005,53: 8093-8105.
（编辑：张学智，）
王雅倩,扬州大学动物科学与技术学院,225009,江苏扬州。
赵国琦(通讯作者)、俞路，单位及通讯地址同第一作者。
闫韩韩，山东省胶南市畜牧兽医局海青动物防疫监督站。
收稿日期：2008-11-10
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