闫韩韩 王 红
摘 要 实验用装有永久性瘤胃瘘管的健康山羊通过瘤胃微生物的计数研究添加某些有益于瘤胃微生物生长和繁殖的物质对瘤胃微生物种类和数量的影响。实验将4只山羊随机分成2组饲喂两种不同的日粮，试验组在饲喂基础日粮的基础上添加葡萄糖、尿素和无机盐等。对照组仅饲喂基础日粮。实验结果表明：在添加葡萄糖、尿素和无机盐等物质的日粮饲喂后，羊瘤胃内的微生物种类和数量呈现增加趋势。
关键词 羊；微生物；细菌；纤毛虫；计数
中图分类号 S826
实验通过瘤胃微生物的计数来研究日粮中添加葡萄糖、尿素、无机盐等物质后对瘤胃微生物种类和数量的影响。葡萄糖可为瘤胃微生物提供能量，增加氨基酸的合成。实验中添加的尿素可以为瘤胃微生物提供氮源，尤其是经过处理后的尿素，可以使尿素氮缓慢的释放，减少了瘤胃内NH3-N瞬间释放量，有利于微生物对NH3-N的利用。无机盐类含有钠、钾、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐等，基本上可满足细菌的生长需要。盐对于微生物生长的影响较为复杂。一般来说，盐类浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而有些盐类在较低浓度时却能刺激生长。也有些细菌在较高浓度的盐分中才能发育生长，微生物为了生存和生长，需要无机盐。
通过实验结果表明，在饲喂添加了葡萄糖、尿素、无机盐等物质的日粮后，羊瘤胃微生物在种类和数量上均产生了变化。瘤胃中微生物的含量有增加。
1 材料与方法
1.1 实验动物
将4只30～45 kg的成年母羊随机分组,并分别编号为1、2、3、4号。装置永久性瘤胃瘘管,瘘管直径为2.5 cm。在实验期间混圈饲养,单独饲喂。并自由饮水。
1.2 实验设计
采用对比法，实验期为15 d，预适用期为10 d。A组为1号羊、2号羊、3号羊，B组为4号羊。以A组为实验组，B组为对照组，两组分别饲喂2种不同的日粮饲料，A组喂给实验日粮(基础日粮+葡萄糖、尿素、无机盐等)，B组喂给基础日粮。
1.3 日粮组成
对照组日粮为基础日粮,日粮粗蛋白质(CP)和代谢能(ME)含量均参照GB/T6432制定。日粮成分见表1。实验日粮为添加实验试剂的日粮，该日粮要充分搅拌均匀。日粮添加成分见表2。
1.4 样本采集
1.4.1 采集用品
200 ml试管、保鲜袋、水桶、报纸等。
在饲喂前每只羊采集瘤胃液100 ml,饲喂后实验期中再采集100 ml。每次采集后立即测pH值，然后置于4 ℃冰箱内保存备用。
1.4.2 采样方法
将羊单独拴于一处，一人保定羊只，另一人采集，采集完的样品迅速包好装袋，防止污染。待全部采集完后放入冰箱保存备用。
1.5 培养基的制备
1.5.1 制备培养基所需实验用品
土豆、西红柿、蒸馏水；托盘、刀子、纱布、烧杯、量筒、锅、培养皿、葡萄糖瓶子、线、高压灭菌器等。
1.5.2 实验用化学制品
葡萄糖、营养琼脂、水解乳蛋白、琼脂等。
1.5.3 土豆培养基的制备
土豆富含适于细菌生长的因子。
① 将1 500～1 800 g土豆洗净，去皮，切成小块，约玉米粒大小。
② 按500 g土豆兑1 000 ml水的比例，将土豆加水放入锅中煮30 min（或116 ℃煮20 min）至熟，然后双层纱布过滤出土豆汁。
③ 取土豆汁150 ml装入干净的葡萄糖瓶中，加入葡萄糖3 g、琼脂6 g，再加水至300 ml，加热溶化，调节pH值至5.8。
④ 在瓶口加入线绳盖在橡皮塞下，放入121 ℃高压灭菌器内灭菌20 min。然后取出备用。土豆培养基制备配方：土豆汁300 ml、葡萄糖（2%）6 g、营养琼脂（3.8%）11.4 g，pH值为6.2。
1.5.4 西红柿培养基的制备
西红柿汁适宜于乳酸菌的生长。要求原料西红柿新鲜，红皮，成熟度基本一致，清洗后在90~95 ℃热水中烫3 min，使外皮软裂，主要作用是杀灭西红柿表面的微生物和虫卵，破坏酶的活性，提高出汁率。然后榨汁。西红柿的出汁率可达80%~90%，经胶体磨均质5 min后由内碳酸钠调节酸度，使pH值达到6.2左右，因为西红柿汁本身的酸度较高，不利于乳酸菌的生长繁殖。
① 取1 500 g西红柿热水烫去皮，在托盘中切碎，双层纱布过滤榨汁。
② 取西红柿汁15 ml，加入水解乳蛋白3 g、营养琼脂11.4 g，再加水至300 ml，加热溶解，调节pH值至6.0~6.2。
③ 在瓶口加入线绳盖在橡皮塞下，放入121 ℃高压灭菌器内灭菌20 min。然后取出备用。西红柿培养基制备配方：西红柿汁20 ml、水解乳蛋白10 g、营养琼脂15.2 g，pH值为6.2。
1.5.5 培养基的制成
将培养皿与土豆混合培养液和西红柿混合培养液一同放入高压灭菌器121 ℃，20 min灭菌。将在高压灭菌器中灭菌了的土豆混合培养液和西红柿混合培养液冷却至60 ℃时,在超净工作台上,开启后15 min在点燃着的酒精灯旁5 cm范围内倒入培养皿中，倒入量以盖住培养皿底为好。然后在酒精灯点燃的情况下冷却凝固，然后在培养皿底面标上标志及编号，并根据实验要求划分好区域备用。
1.6 瘤胃液的稀释
1.6.1 瘤胃液稀释所需用品
青霉素小瓶40个，移液管2支，与移液管相匹配的两种枪头，灭菌后的生理盐水，大烧杯一个。
按4.5 g氯化钠加500 ml蒸馏水的比例配制0.9%的生理盐水，然后将青霉素小瓶每6～8个用报纸包好，培养皿也同样是每5～6个包一包连同移液管枪头放入121 ℃高压灭菌器60 min灭菌。然后取出备用。
1.6.2 瘤胃液的稀释
将青霉素小瓶每9个一组共分4组36个,每组一排,并将每组第一个青霉素小瓶标号1、2、3、4,然后用培养皿盛生理盐水,采用的2支移液管分别是1 000 μl和500 μl的，1 000 μl移液管向每个青霉素小瓶移入4次共4 000 μl，再用500 μl的移液管向每个青霉素小瓶移入500 μl。
将采集的瘤胃液按标号用移液管移取50 ml，充分混匀的瘤胃液，依次按编号注入相应的每组编号的第一个青霉素小瓶中，然后按枪头将含瘤胃液的青霉素小瓶充分混匀后吸取50 ml注入后面8个瓶中的一号瓶，再换枪头，再充分混匀，依此方法做下去。注意自前一个瓶移取液体至后一个瓶时，枪头尽量不要碰到瓶壁和瓶内的生理盐水。每一个小瓶换一个枪头，这样至最后一个瓶混匀后，取50 ml液体弃掉，将4组全部稀释完。
1.7 瘤胃液微生物的接种和培养
将已经标号的培养基与每组后面的5、6、7、8号青霉素瓶在超净工作台上点燃酒精灯,在酒精灯旁用20 ml移液管按编号接种至相应的培养基上。每种培养基做两次,共16个培养皿。接种完毕后在超净工作台上(酒精灯不灭)风干。风干后将西红柿培养皿放入厌氧环境培养，点燃厌氧罐内的蜡烛盖好盖子，待蜡烛熄灭后放入二氧化碳培养箱作厌氧培养,培养时间为27 h。土豆培养基则放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。
1.8 瘤胃液微生物的计数
细菌计数依据公式：瘤胃液原汁20 ml+灭菌生理盐水180 ml。连续10倍8次梯度稀释。每平皿取样50 μl，选择适宜稀释度做3个平行实验。
细菌数计算公式：20×（3个平皿菌落数×稀释度/3）=菌数/ml。
细菌的分类：瘤胃液细菌计数分类参照斯塔尼尔等（1983）和陆承平（2001）的方法，即将细菌分为酵母菌、乳酸杆菌、芽孢菌分别计数。
1.8.1 瘤胃厌氧真菌计数
瘤胃厌氧真菌可分泌活性纤维素酶和半纤维素酶，这些酶在瘤胃植物纤维的消化中起重要作用。瘤胃厌氧真菌可穿透阻止瘤胃细菌进入的角质层屏障，从而使各类瘤胃微生物分泌的水解酶附着在底物上。
1.8.2 实验注意事项
① 注意实验程序中的无菌操作，避免杂菌生长，影响试验结果。
② 严格执行实验规定数据。
③ 实验用品使用时注意保护，不能损坏。
④ 严格按照实验步骤进行试验。
2 结果与分析
2.1 pH值的变化（见表3）
饲喂实验日粮后，处理组瘤胃液pH值在5.78～5.82，各组之间差异均不显著（P>0.05）。Ternouth等（1971）、Mackie等(1984)研究表明，高渗透压抑制瘤胃内纤维分解，并降低采食量。日粮组成和水是影响渗透压的主要因素。反刍动物本身具有调节pH值的能力——缓冲液，唾液是瘤胃缓冲液的主要来源，它能稳定瘤胃pH值，提高食糜流通率，当日粮由高粗料转为高精料时，高精料水平使瘤胃中有机酸总量升高，且唾液分泌减少，导致瘤胃pH值急剧下降，从而抑制微生物的生长。
2.2 瘤胃稀释率
瘤胃稀释率是指每小时排出瘤胃的量占瘤胃总容积的比例,已有大量报道证明了瘤胃稀释率与MCP合成间存在正相关关系。Isaacson(1975)报道,提高瘤胃稀释率能够改变瘤胃发酵参数,提高MCP的合成。Cole等(1976)发现，当瘤胃稀释率由0.03/h增加到0.05/h,MCP合成由7.5 g提高到11.8 g/100 g DMD。Kennedy等（1978）通过降温使瘤胃外排速度由0.068/h增至0.136/h，MCP产量提高2%。但外排过速、食糜停留在瘤胃中时间过短,影响微生物的增殖,反而降低MCP产量，由于微生物种类繁多且分裂周期各异，因而很难找到一个最佳的外排速度。
2.3 2种日粮条件下羊瘤胃液细菌数的变化
羊瘤胃液细菌总数随日龄增长而不断增加。羊瘤胃液中乳酸杆菌的数量随实验日期推进而不断增加，而且一直持续到实验末期。羊瘤胃液芽孢杆菌的数量也是随实验日期推进而不断增加。羊瘤胃液中的酵母菌的数量也均随着实验日期推进而不断增加。
2.4 瘤胃微生物数量的变化
通过计数显示实验组的瘤胃微生物数量比对照组高，可见所添加的葡萄糖、尿素、无机盐等物质起了促进瘤胃微生物生长和繁殖的作用。
比较见表4、表5和表6、表7。
为更加清晰地分析结果，再绘制表8比较投料前与投料后的结果差异。
由表8可见，1、2、3号羊在试验期饲喂葡萄糖、尿素和无机盐等物质后瘤胃微生物的数量呈上升趋势。
3 讨论
3.1 羊试验日期与瘤胃液细菌数量的关系
瘤胃微生物包括原虫（即纤毛虫）、细菌、真菌和噬菌体4类。本试验结果清楚地表明，羊瘤胃液原虫和细菌数量是随着动物的试验日期而增加的，提示了瘤胃微生物消化是一个不断发育的过程，但同时也表明各种微生物数量变化的差异性，从总体看，原虫和细菌总数在试验中呈现上升趋势，但在整个试验期原虫的增量比细菌要大，而且不同形态的细菌的增速和数量也不相同。如果考虑到在试验期瘤胃液体积也增加了15倍，瘤胃细菌数则增加了30倍以上，而原虫数增加了60倍以上。
3.2 羊日粮能量、蛋白质水平与瘤胃液细菌数量的关系
显而易见，日粮的能量水平影响瘤胃液中原虫的数量，日粮中可消化能量高，原虫数量就多，而蛋白质水平的影响就不明显。除了瘤胃大杆菌数量受日粮的蛋白质水平影响之外，日粮的能量、蛋白质水平对瘤胃液细菌总数或其它各种细菌数量的影响不显著。因此可以初步认为羊日粮与瘤胃微生物的关系主要表现在日粮中可消化能量与原虫的数量关系上。
3.3 羊瘤胃液细菌数量与消化代谢的关系
将羊对日粮中纤维素、半纤维素消化率随日龄的变化与瘤胃原虫、细菌总数和各种细菌数（除新月芽菌外）随日龄的变化相比照，可以认为瘤胃微生物数量的增加提高了动物对日粮中纤维素、半纤维素的消化能力（朱文涛等，2004）。从本试验结果看，是与微生物的数量，特别是原虫数量的增加有关。因此，研究怎样延缓瘤胃液中微生物数量的增加，特别是限制原虫数量的增加，可能是提高或保持羊较高饲料转化率的一个新途径。日粮的能量、蛋白质水平对瘤胃液细菌总数或其它各种细菌数量的影响不显著。因此可以初步认为羊日粮与瘤胃微生物的关系主要表现在日粮中可消化能量与原虫的数量关系上。
3.4 反刍动物瘤胃微生物对机体的作用
3.4.1 对机体的有利作用
瘤胃内的原虫至少有30种以上，主要是属于纤毛虫纲，约有130多种纤毛虫，也有少数鞭毛虫纲的。纤毛虫数量为每毫升105～106个，仅在瘤胃中生长发育，都是专性厌氧微生物。原虫可降解总纤维量的25％～30%,但其主要发酵底物是淀粉和可溶性糖。业已证实，瘤胃原虫体内含有许多酶类，如L-淀粉酶，蔗糖酶、果聚糖酶、半纤维素酶、纤维素酶、蛋白酶、脱氨基酸酶等，故有分解相应物质的能力。能显著提高饲料的消化率和利用率。原虫发酵糖类能产生乙酸、丁酸、乳酸，也产生少量丙酸、CO2和氢。通过降低瘤胃内淀粉和可溶性糖的浓度，达到稳定瘤胃pH值的作用。瘤胃原虫不能用简单的含氮化合物合成氨基酸,主要靠吞食细菌获得氨基酸，合成自身蛋白质。
实验证实，在饲喂粗料及干草比例较高时，原虫可明显改善动物消化率和提高增重，而在精料较高时则不甚显著。对以秸秆型日粮饲养的肉牛，用莫能霉素去除原虫后，试验组显示日增重较低的趋势。这说明野生反刍动物以草为生，瘤胃原虫的存在对消化纤维素有其重要意义。
3.4.2 对机体的不利作用
在反刍动物瘤胃微生物区系中，虽然原虫和细菌各占比例相等，但就细菌的数量、代谢活动强度以及对机体的生理功能，远远超过原虫。有人认为原虫对反刍动物并不是必不可少的，减少或去除原虫的理由，即原虫对机体的不利作用是：①原虫能吞噬大量细菌，影响了细菌在瘤胃生态系中的生理作用。原虫通过自溶作用进行代谢，而自溶作用产生的NH3不能被再次利用，造成了氮的无效循环，增加了氮的纯损失，减少到达小肠的氨基酸总量。②对代谢的影响。许多学者研究表明，反刍动物去除原虫后瘤胃内挥发性脂肪酸总量未发生变化，但其成分比例发生变化，其中乙酸与丙酸摩尔比降低，丙酸增加。丙酸是反刍动物葡萄糖的主要来源，尤其对于高产奶牛，其所需葡萄糖的绝大部分由丙酸提供。因此，去除原虫后，可更好地保障动物对能量的需要。
4 结论
① 西红柿培养基培养的是乳酸菌，实验显示，在投料前A组1 g瘤胃液中细菌平均数分别为2.93×107、1.53×107、1.09×107、0.62×107，而投入葡萄糖、尿素、无机盐后1 g瘤胃液中含有的细菌数分别上升至7.07×107、6.47×107、5.2×107、3.8×107，细菌数在投料后比投料前分别增加了4.14×107、4.94×107、4.01×107、3.18×107。而在投料前B组1 g瘤胃液中细菌平均数分别为2.4×107、 1.8×107、1.2×107、0.6×107，而投入葡萄糖、尿素、无机盐后1 g瘤胃液中含有的细菌数分别为2.26×107、1.6×107、1.4×107、0.6×107,细菌数在投料后比投料前分别增加了-0.14×107、-0.2×107、0.2×107、0。由此可见A组的细菌数是呈明显增加趋势的，而B组细菌数则变化不明显，通过实验细菌数总数呈现增长趋势，是符合实验设想的，实验是成功的。
② 土豆培养基培养的是芽孢菌和酵母菌，实验显示，在投料前A组1 g瘤胃液中细菌平均数分别为4.47×106、0.178×106、0.25×106、0.18×106，而投入葡萄糖、尿素、无机盐后1 g瘤胃液中含有的细菌数分别为2.13×107、1.33×107、7.34×106、0.42×106，细菌数在投料后比投料前分别增加了1.70×107、1.32×107、7.09×106、0.24×106。而在投料前B组1 g瘤胃液中细菌平均数分别为0.6×106、0.13×106、0.27×106、0.13×106，而投入葡萄糖、尿素、无机盐后1 g瘤胃液中含有的细菌数分别为0.53×106、0.4×106、0.27×106、0.13×106，细菌数在投料后比投料前分别增加了-0.07×106、0.27×106、0、0。由此可见A组的细菌数是呈明显增加趋势的,而B组细菌数则变化不明显，通过实验细菌数总数呈现增长趋势的，是符合实验设想的，实验是成功的。
通过实验显示投料前比投料后差异明显。由此也可证明羊瘤胃液中原虫和细菌的数量随试验日期而不断增加，其中芽孢菌数量的增加多于乳酸菌，日粮中添加的葡萄糖、尿素和无机盐等物质主要影响瘤胃液中微生物的数量，而对微生物的种类无显著影响。
（参考文献若干篇，刊略，需者可函索）
（编辑：张学智，）
闫韩韩，山东省胶南市畜牧兽医局海青动物防疫监督站，266415，山东胶南。
王红，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-04-20 |
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