王潍波 赵国琦 郭熠洁
近年来，国外报道过一些糖和加热保护处理可降低优质蛋白质饲料在瘤胃中的降解率，此种方法以糖为保护剂，安全、无污染，在保护方法上是一个突破，改变了以往保护剂如血粉、甲醛等不切合实际应用的不足。本试验旨在用瘤胃液体外培养法评定葡萄糖非酶褐化豆粕对奶牛瘤胃内环境参数的影响，为探索新型饲料蛋白质保护剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理方法
1.1.1 葡萄糖由安徽丰原生物化学股份有限公司提供，豆粕由扬州大学奶牛场提供。
1.1.2 处理方法
两种日粮的各营养指标相同：一组为对照组A0（未添加）、另一组为处理组，每个处理设3个重复，采用单因子2水平有重复试验设计。豆粕样品的处理为：将占豆粕干物质的3%的葡萄糖和适量的蒸馏水（使豆粕中的含水量达到20%）混匀，然后均匀喷洒到豆粕上，在115 ℃烘箱中加热120 min，在室温下晾干后备用。
1.2 试验日粮（见表1）
1.3 试验设计与体外培养
1.3.1 试验设计
体外培养的底物是奶牛全价混合日粮（Total Mixed Ration，TMR），并且粉碎过40目筛。采用随机试验的方法，每种处理方法设3个重复进行体外发酵试验。
1.3.2 体外发酵装置与人工唾液
由普通恒温水浴箱、锥形瓶、震荡器和CO2钢瓶组成。锥形瓶进样口用橡皮塞密闭，设有两个通路，一个进行气体交换，一个供应CO2。
人工唾液采用Menke等(1988)的方法配制[1]，pH值为7.1±0.15。具体配方为：1 000 ml人工唾液中含有缓冲液237 ml、常量矿物盐溶液237 ml、微量矿物盐溶液0.12 ml、其余为蒸馏水,另加葡萄糖10 g,(NH4)2SO4 0.503 2 g。
1.3.3 瘤胃液的采集
饲喂前分别从3头荷斯坦奶牛的瘤胃中,利用自制真空负压过滤装置采取瘤胃液各300 ml混合均匀,灌入39 ℃并通有CO2的事先消过毒的500 ml的锥形瓶中进行保温，立即盖严瓶口，迅速返回实验室于39 ℃水浴保温并持续通入CO2以保持厌氧的环境。
1.3.4 体外培养
分别称取2.0 g左右粉碎40目的日粮，装于不同编号的锥形瓶中。用量筒分别量取人工唾液80 ml，再分别加入瘤胃液40 ml，置于不同编号的锥形瓶中，并摇晃使其混合均匀,将锥形瓶置于39 ℃的恒温水浴摇床上进行培养。
1.3.5 样品的采集
培养后0、2、4、6、12、24 h六个时间点用真空负压过滤装置采样，分别测培养液的pH值，然后放于-20 ℃冰箱保存,用于测定NH3-N和微生物蛋白的产量。
1.4 样品的分析
培养液pH值用便携式pH计于采样后立即测定。
培养液NH3-N浓度采用酚-次氯酸钠比色法测定[2]。
微生物蛋白采用比色法测定[3]。
1.5 数据处理
试验数据采用Excel软件进行整理,运用SPSS统计软件进行统计分析，对差异显著者采用LSD法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖处理对培养液中pH值的影响(见表2)
饲喂两种日粮条件下，培养液pH值动态变化规律由表2可以看出,pH值变动范围为6.27～7.09,6.28～7.18，平均值为6.62、6.66，pH值都在正常的生理范围内变动(pH值5.5～7.5)。从不同日粮同一时间的pH值变化来看，组间差异不显著（P＞0.05），这说明随着处理水平的不同微生物的发酵特性也在发生变化，但是并没有最终影响到发酵模式的显著变化。从不同时间pH值的变化可以看出,两组从开始体外培养到培养的6 h内,培养液pH值一直呈下降趋势，之后开始上升。
2.2 葡萄糖处理对培养液中NH3-N浓度的影响（见表3）
由表3可见，瘤胃内氨的含量变动很大，动物采集后2 h达峰值，大体上反映饲料的含氮量、含氮物的可溶性和分解的速度。两组的产氨量在进食后都呈先上升后回落的趋势。两组NH3-N浓度平均值分别为15.90、11.63 mg/100 ml，浓度变动与文献报导值（0.17～14.50 mg/100 ml）[4]大致相符，但处理组浓度波动较大，两组间差异极显著（P<0.01）。从不同时间点来看,在体外培养2 h时,培养液NH3-N浓度均上升至最高点,然后下降,虽然随着培养时间的增加NH3-N浓度有上升的趋势，但总体呈下降趋势。
2.3 葡萄糖处理对培养液中微生物蛋白产量的影响（见表4）
由表4可见，两组微生物蛋白含量变化范围分别1.74～3.97、1.73～3.86 mg/100 ml。平均值分别为3.25、3.08 mg/100 ml。从不同时间发现各组随着培养时间的增加微生物蛋白的产量逐渐增加,在培养0 h时,两组间差异不显著(P＞0.05),2 h时,两组微生物蛋白含量之间差异极显著(P<0.01),但是在4 h时,两组微生物蛋白含量之间差异显著(P<0.05),其余时间点均差异不显著,可见葡萄糖处理豆粕没有抑制微生物蛋白的增加。
3 讨论
3.1 体外培养条件下葡萄糖处理对培养液pH值的影响
瘤胃液pH值是一项反映瘤胃发酵水平的综合指标，受日粮结构、原料种类及加工形式、饲喂方式、唾液分泌的多寡、VFA及其它有机酸生成、吸收和排出等诸多因素的影响[5]，而引起瘤胃pH值波动的根本原因则是日粮结构和日粮营养[6]。本试验中，两组培养液平均值为6.62、6.66，pH值都在正常的生理范围内变动。瘤胃微生物的正常活动与繁殖要求环境保持一定的pH值，瘤胃液pH值的正常变化范围是5.5～7.5，当pH值低于下限时，瘤胃内的微生物活力降低、数量减少甚至完全被酸性环境杀死，对机体生理机能有很大的影响[7]。瘤胃蛋白酶活性的最适pH值为6.0，低于此值会极大地降低蛋白质的消化作用[8]，而姜卫红等(1986)[9]的系列研究指出pH值为7.0时蛋白酶的活性最高。其次，受pH值影响最大的是纤维分解菌，纤维分解菌对pH值的变化最为敏感，分解纤维素的最适pH值为6.2～7.0[10]，pH值低于6.2会影响纤维素的消化，使粗饲料的消化率下降，而淀粉分解菌对于pH值则不敏感[11]。本试验中各处理组pH值均都高于6.2，因此不会影响瘤胃微生物的正常活动。
本试验中，处理组pH值为6.28～7.18，两组之间不存在显著差异，而且都有相同的变化趋势，豆粕处理下的培养液pH值平均值没有显著变化，这说明葡萄糖处理对瘤胃的发酵环境没有产生不利的影响。pH值随着体外培养时间的推移而呈下降趋势,这是因为微生物对碳水化合物成分发酵产生大量的VFA,同时利用发酵饲料中的蛋白质部分而产生的氨而使得培养液pH值逐渐下降。动物机体可通过自身的稳衡机制，使瘤胃液pH值保持在一定范围内，以确保瘤胃微生物区系的正常繁殖和所采食饲料的消化吸收[12]。由于本试验采用的是不连续发酵装置，其缺点是发酵容器内的内容物不能外移，造成发酵终产物积累[10],人工唾液的缓冲能力也会随时间的延长而降低。
3.2 体外培养条件下葡萄糖处理对培养液NH3-N浓度的影响
氨氮是瘤胃微生物发酵的主要氮源,是影响微生物活性的重要指标,适宜的氨氮浓度是保证微生物蛋白合成效率的首要条件[13]。瘤胃微生物将饲料中相当一部分的含氮化合物降解成氨,瘤胃中氨氮浓度是反映氮代谢的重要指标，而它主要取决于日粮氮降解速度和微生物对氨的利用。一般情况下,瘤胃液氨氮水平处于动态平衡状况,但氨氮水平不仅受氮采食量的影响,同时受饲料蛋白降解度、瘤胃微生物合成速度、瘤胃上皮对氨氮的吸收和内源含氮物质的周转以及能量水平等因素的影响较大,可见瘤胃NH3-N浓度是影响微生物活力的一个重要指标。氨氮浓度在一定程度上反映了瘤胃微生物分解含氮物质产NH3的速度及其对NH3的摄取利用情况，反映了特定日粮组成下,蛋白质降解与合成之间所达到的平衡[14]。本试验中,两组NH3-N浓度的均值分别为15.90、11.63 mg/100 ml；此值高出大部分文献报道的范围，但在Preston等(1987)提出的微生物生长对氨氮浓度耐受的临界范围内（6～30 mg/100 ml[15]）。
采食对不同时间点的瘤胃氨氮浓度变化有显著影响。从试验结果看，采食前和采食后氨氮浓度有极显著性的差异。原因是采食为微生物提供营养，微生物活性增强，使得饲料中蛋白氮不断降解释放，引起食后氨氮浓度的迅速升高，而后，微生物利用氨氮合成微生物蛋白以及瘤胃壁的吸收，以及内容物进入后段消化道，引起氨氮浓度又逐渐下降。在本试验中，各组都有相同的变化趋势，都是在培养2 h后食糜中NH3-N浓度达到最大而后逐渐降低，但是在培养12 h时NH3-N浓度又有一个升高的趋势，这可能是由于前期发酵产物的抑制作用得以解除后，微生物又开始发酵的结果。葡萄糖处理组极显著低于对照组，这是因为葡萄糖处理豆粕后，由于对豆粕蛋白质进行了保护，提供给微生物可发酵的氮源减少从而降低了培养液中NH3-N浓度。氨氮浓度小于2.50 mg/100 ml时，发酵的“解偶联”作用引起微生物产量低，生产效率下降,该值被广泛用作瘤胃最低氨氮浓度标准[16]。在本试验中,各组氨氮浓度均高于此值。根据试验结果可知，由于葡萄糖的添加,对豆粕的保护效果明显,对豆粕加热处理前加入葡萄糖,这种结合处理法能够通过提高与蛋白质反应的糖醛的利用率,来增加非酶促褐变反应的程度,同时又不会降低蛋白质饲料的降解率。
3.3 体外培养条件下葡萄糖处理对培养液中微生物蛋白产量的影响
瘤胃微生物的合成数量对反刍动物的生产性能产生重要影响。能量、蛋白质、进食水平、青贮饲料等都是影响瘤胃微生物蛋白质产量的营养因素[17]。研究表明，降解氮转化为微生物氮的效率受饲料蛋白的降解量、降解速度及降解氮与微生物可利用能量的平衡影响[18-19],不同来源可发酵碳水化合物和可降解氮的瘤胃微生物蛋白合成效率差异显著[20]。本研究表明，各组微生物蛋白的产量在采食后逐渐增加，且组间变化差异很大。培养液中微生物的生长速度与蛋白质保护有密切关系。在各组中，随着培养时间的增加微生物蛋白的含量也逐渐增加，以对照组的微生物蛋白氮产量最高，平均值为3.25 mg/100 ml，在培养0 h时，两组间差异不显著(P＞0.05)，2、4 h时，两组微生物蛋白含量之间差异极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)，但是在6、12、24 h，两组微生物蛋白含量之间差异不显著(P>0.05)。在微生物蛋白变化曲线中可以发现，两组呈现相同的变化趋势，都是随着培养时间的增加微生物蛋白的含量也逐渐增加，但葡萄糖处理组的微生物蛋白含量一直低于对照组。这是因为葡萄糖加热处理大豆粕后，使得豆粕蛋白的降解部分减少，满足不了微生物的需求，从而使微生物所需的氮源不足所致。
4 小结
葡萄糖处理组pH值为6.28～7.18，两组平均值分别为6.62、6.66，两组之间不存在显著差异。两组中NH3-N浓度的均值分别为15.90、11.63 mg/100 ml,差异极显著(P<0.01)。从不同时间点来看,在体外培养2 h时,培养液NH3-N浓度均上升至最高点,然后下降,虽然随着培养时间的增加NH3-N浓度有上升的趋势,但与对照组相比总体呈下降趋势。两组微生物蛋白含量变化范围分别1.74～3.97、1.73～3.86 mg/100 ml。平均值分别为3.25、3.08 mg/100 ml，在培养0 h时，两组间差异不显著(P＞0.05),2 h时,两组微生物蛋白含量之间差异极显著(P<0.01),但是在4 h时,两组微生物蛋白含量之间差异显著(P<0.05),其余时间点均差异不显著。综合本试验的测定结果,发现在葡萄糖处理组的保护效果明显，既没有抑制微生物的活动，使粗饲料得到充分的降解,又防止了豆粕的过分降解,结合NH3-N和微生物蛋白的产生量可以得到很好的说明，所以本试验认为葡萄糖处理对于豆粕能产生积极的保护效果。
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（编辑：张学智，）
王潍波,扬州大学动物科学与技术学院,225009,江苏扬州。
赵国琦、郭熠洁，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2009-05-18
★ 国家科技资助基金项目“奶牛高效饲养关键技术研究及开发”（2006BAD04A03-07） |
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